試劑、試劑盒 封閉緩沖液封閉試劑抗體LB 頂層瓊脂糖LB 平板瓊脂培養基
儀器、耗材 硝酸纖維素濾膜λ噬菌體載體cDNA 文庫
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的組分請見附錄 12。
將貯存液稀釋到適當的濃度。
封閉緩沖液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
封閉試劑 [1%(m/V）明膠，3%(m/V) 牛血清白蛋白，或 5%（m/V) 脫脂奶粉]
對于這些封閉實際的優點，不同實驗室各執一詞。我們建議使用者進行預試驗確定哪種封閉液與所選擇的第一抗體和第二抗體匹封最優。封閉液可以貯存于 4°C, 重復使用數次。加入疊氮化鈉至終濃度為 0.05%(m/V) 用以抑制微生物的生長。
抗體
制備用于文庫篩選的抗體
培養基
LB 平板瓊脂培養基
每 90 mm 陪氏細菌培養皿需 30~35 ml 瓊脂培養基。每 150 mm 平板需約 50 ml 瓊脂培養基。平板必須干燥，否則，當硝酸纖維素濾膜取出時，頂層瓊脂糖會被揭掉。通常，兩天前制備的平板在使用前將蓋略微揭開，在 37°C 溫育1~2 h, 效果很好。
LB 頂層瓊脂糖
用前在微波爐中短時加熱熔化頂層瓊脂糖，然后冷卻至 47°C。將熔化的頂層瓊脂在無菌管中分成 3 ml 等份（90 mm 平扳）或 7.5 ml 等份（150 mm 平板)。將分好的等份放在 47°C 干燥器或水浴中以防止頂層瓊脂凝固。
專用設備
硝酸纖維素濾膜
適合用于結合蛋白質及免疫印跡的包括無 Triton X-100 硝酸纖維素濾膜（Millipore HATF 或等同產品）和硝酸纖維素衍生支持物，如 Hjrbond-C extra[Amersham Pharmarcia Biotech 公司]。尼龍膜和帶極性尼龍膜因為固定蛋白質的能力差且背景髙而不適用于免疫篩選。
附加試劑
本節步驟 1 需要第 2 章方案 1 所列試劑。
本節步驟 2 需要本章方案 1 所列試劑。
載體和菌株
λ噬菌體載體
利用表達載體和菌株構建所需 cDNA 文庫
方法
1. 將非重組λ噬菌體鋪在 10 塊瓊脂平板上，以得到半融合裂解的菌苔（請見第 2 章方案 1)。
2. 按方案 1 步驟 5~12 所述，但略去 IPTG 處理，制備硝酸纖維素濾膜上的裂解菌苔印痕。
不必按方案 1 步驟 8 所述標記濾膜。
3. 用封閉液以 1:10 稀釋用于篩選的抗體制劑。
4. 將濾膜與稀釋的抗體共同溫育 6 h。在處理后的抗體中加入 0.05% 疊氮化鈉，保存于 4°C 以備免疫篩選時使用。
稍加修改后，該方法即可用于細菌菌落的候篩選以去除抗大腸桿菌抗體可以在硝酸纖維素濾膜上固定一些不含有插入 cDNA 表達載體的細菌菌落（請見方案 2）。然后按方案 2 步驟 10~16 進行細胞裂解及洗膜。最后，按上述步驟 3 和 4 處理抗血清。