實驗方法原理
雙向免疫擴散試驗不僅可對抗原或抗體進行定性鑒定和測定效價，還可對抗原或抗體進行純度分析和同時對兩種不同來源的抗原或抗體進行比較，分析其所含成分的異同。
若在兩孔內有兩對或兩對以上的抗原抗體系統，就能產生相應數量的分離的沉淀線（圖 1）。因此，利用此法可進行抗原或抗體的純度分析。
圖 1 雙向免疫擴散平板所表現的沉淀線數量
A. 單個抗原抗體系統
B. 多個抗原抗體系統
沉淀線形成的位置與抗原、抗體濃度有關，抗原濃度越濃，形成的沉淀線距離抗原孔越遠，抗體濃度越濃，形成的沉淀線距抗體孔越遠（圖 2），因此，當固定抗體的濃度，稀釋抗原，可根據已知濃度的抗原沉淀線的位置，測定未知抗原的濃度；反之固定抗原的濃度，亦可測定抗體的效價。
圖 2 雙向免疫擴散平板中表現的沉淀線與各抗原孔的不同距離
Ab：抗體，周圍孔為抗原
此外觀察兩個鄰近孔的抗原與抗體所形成的兩條線是交叉抑或相連，可用來判斷該兩抗原是否有共同成分（圖 3）。假如同樣的純抗原 a 放在兩個鄰近的孔中，對應抗體放在中央孔中，兩條沉淀線在其相鄰的末端會互相連接和融合；若兩個不同的抗原 a 和 b，則兩線互相交叉；若兩個抗原有部分相同成分 a 和 ab，則兩線除有相連部分以外還有一伸出部分。
A. 相鄰兩孔的抗原相同；B. 抗原不同；C. 抗原有部分相同
實驗材料 兔抗馬血清馬血清牛血清山羊血清人血清
試劑、試劑盒 1％ 離子瓊脂
儀器、耗材 方陣型打孔器或單孔金屬管（孔徑約 3 mm）吸管毛細滴管2.5×7 cm 載玻片、注射針頭含濕濾紙或濕紗布的培養皿或帶蓋搪瓷盒
實驗步驟
1. 在沸水浴中溶解 1％ 離子瓊脂。
2. 冷至 50～60℃ 左右，吸 3.5～4 ml 加在載玻片（必須放在水平位置）上，使其均勻布滿玻片而又不流失。
3. 瓊脂凝固后，取方陣型打孔器打孔，或單孔金屬管按圖 4 打孔，再用注射針頭挑去孔中瓊脂，每瓊脂板打兩個方陣型。
圖 4 雙向擴散型
孔徑約 3 mm；與中央孔的距離 5～6 mm
4. 用記號筆在瓊脂板的底面將孔編號。
5. 用毛細滴管加兔抗馬血清抗體于兩個方陣型的中央孔中，第一方陣型的周圍孔 1 加牛血清，孔 2 加馬血清，孔 3 加羊血清，孔 4 加入血清。第二方陣型周圍各孔加入的抗原與第一方陣型相同，但濃度均改為 1：20。
6. 將玻片放入有濕濾紙的培養板或有蓋搪瓷盒內。
7. 置37 ℃ 溫箱，24～48 h 后取出觀察結果。
注意事項
所加血清與抗血清不能溢出孔外。