蛋白質是兩性分子，在不同的pH環境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。對每個蛋白質來說都有一個特定的pH，此時蛋白質的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質的等電點(pI)。將蛋白質樣品加載至pH梯度介質上進行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質子，并且隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數和遷移速度下降。當蛋白質遷移至其等電點pH位置時，其凈電荷數為零，在電場中不再移動。聚焦是一個與pH相關的平衡過程：蛋白質以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI值；在等電聚焦過程中，蛋白質可以從各個方向移動到它的恒定位點。