2．[操作步驟]
1. 將標準品BSA(5mg/ml)先稀釋成0.5 mg/ml，
2. 按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl分別加到96孔板中，加DDW補足到20μl。
3. 加適當體積樣品（4μl）到96孔板的樣品孔中，加DDW到20μl。
4. 各孔加入200μl G-250染色液，室溫放置3-5分鐘。
5. 用酶標儀測定A595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度。
6. 根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。
3．[試劑準備]
1. BSA標準牛蛋白血清5mg/ml
2. ELISA96孔板
3. DDW
4. G-250染色液
四、第一向：等電聚焦
1．[基本原理]
從電泳觀點看，蛋白質最主要的特征是它的帶電行為。蛋白質是由20種不同的氨基酸按不同比例通過肽鍵的連接構成的。由于蛋白質的一些氨基酸側鏈在一定的pH值的溶液中是可解離的，從而帶有一定的電荷。構成蛋白質的所有氨基酸殘基上所帶正負電荷的總和便是蛋白質所帶的凈電荷。蛋白質在不同的pH環境中帶不同數量的正電或負電，在低pH時，蛋白質的凈電荷是正的，在高pH時，其凈電荷是負的，但在某一pH時，它的凈電荷為零，此pH即為該蛋白質的等電點（isoelectric
pointpI）。蛋白質的等電點值取決于其氨基酸的組成，是一個物理化學常數。組成每一種蛋白質或多肽的氨基酸的數目和比例是不同的，因此蛋白質的等電點范圍很寬，如某種α-酸性糖蛋白（chimpanzee）的pI可低達1.8，而人胎盤溶菌酶的pI可高達11.7，這樣寬廣的pI范圍使得可以利用它來進行蛋白質的分離和分析。
等電聚焦電泳時，形成正極為酸性，負極為堿性的連續的、穩定的pH梯度。將某種蛋白質（或多種蛋白質的混合物）樣品至于負極端時，因pH＞pI，蛋白質分子帶負電，電泳時向正極移動；在移動過程中，由于pH逐漸下降，蛋白質分子所帶的負電荷量逐漸減少，蛋白質分子移動速度也隨之變慢；當pH＝pI時，蛋白質所帶的凈電荷為零，蛋白質即停止移動。同理當蛋白質樣品至于陽極端時，因pH＜pI，蛋白質分子帶正電，電泳時向負極泳動，移動過程中，pH不斷升高，蛋白質所帶的正電逐漸減少，速度也隨之減慢，直到到達凈電荷為零的等電點位置則停止移動。因此在一個有pH梯度的環境中，對各種不同等電點的蛋白質混合樣品進行電泳，則在電場作用下，不管這些蛋白質分子的原始分布如何，各種蛋白質分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度中相對應的位置處進行聚焦，經過一定時間的電泳以后，不同等電點的蛋白質分子會分別聚集于其相應的等電點位置，這種按等電點的大小，生物分子在pH梯度的某一相應位置上進行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”。各種不同的蛋白質在電泳結束后，形成很窄的一個區帶，很稀的樣品也可進行分離。在等電聚焦中蛋白質區帶的位置，是由電泳的pH梯度的分布和蛋白質的pI所決定的，而與蛋白質分子的大小和形狀無關。
蛋白質到達它的等電點位置后，沒有凈電荷，就不能進一步遷移。如果蛋白帶向陰極擴散，將進入高pH范圍而帶負電，陽極就會將其吸引回去，直到回到凈電荷為零的位置，同理，如果它向陽極擴散而帶正電，陰極則將其吸引回凈電荷為零的位置。因此蛋白質只能在它的等電點位置會被聚集成一條窄而穩定的帶（見圖-1）。所以等電聚焦不僅能獲得不同蛋白質分離和純化效果，同時也能得到蛋白質的濃縮效果。這種〝聚焦效應〞或稱〝濃縮效應〞是等電聚焦最大的優點，是高分辨率的保證。
根據建立pH梯度原理的不同，梯度又分為載體兩性電解質pH梯度（Carrier ampholytes pH
gradients）和固相pH梯度（immobilized pH
gradients）。前者是在電場中通過兩性緩沖離子游離建立pH梯度（線性）。后者是將緩沖基團共價鍵合在介質上成為凝膠介質的一部分而建立pH梯度（線性和非線性），分辨率比前者高一個數量級