由于合成載體兩性電解質（synthetic carrier ampholyte SCA）是通過復雜的合成過程得到的，其重復性很難控制，由此不同批次之間會存在很大的變化，同一蛋白質在不同批
圖-1. 等電聚焦的“聚焦效應”
次等電聚焦中所出現的位置有所偏差，這樣作為雙向電泳中的一向時就限制了蛋白質分離的重復性。另外，SCA分子量相對較小，難以在IEF膠內固定，再等電聚焦過程中由于水合正離子引起電滲流（electroendosmosis）將致使SCA分子向負極遷移（負極漂移），結果使pH值的不穩定性增加。
基于以上的種種因素，20世紀80年代建立起一種新型的等電計較技術—固相pH梯度等電聚焦。固相pH梯度等電聚焦（Immobilized pH
gradients isoelectric focusing,
IPGIEF）是利用一系列具有弱酸或弱堿性質的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點附近形成pH梯度，然后將其共價鍵合在介質上，成為凝膠介質的一部分，從而形成固定的，不隨環境電場等條件變化的pH梯度。與傳統的載體兩性電解質等電聚焦相比，具有更高的分辨率和可重復性，更好的pH值的穩定性，更大的上樣量等優點。分辨率可達0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方式，可用于分析和制備等電點極其相近的蛋白質和多肽，是目前唯一可以分析只有一個氨基酸差異的兩種蛋白質的的電泳方法。
固相pH梯度等電聚焦技術的突破要歸功于Immobilines試劑（Amersham Pharmacia Biotech,
APB）的基礎上開發的固相pH梯度（IPG）技術。Immobilines（固相試劑）是一系列性質穩定的具有弱酸弱堿性質的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的
聚合行為。每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團與丙烯酰胺單連，其結構式為：
其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質中。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。分子另一端的R基團為弱酸或弱堿性的緩沖基團，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH3～10范圍的緩沖體系。見圖-2。
在固相pH梯度的發展中，為了改善結果，簡化操作，把IPG膠灌到塑料支持膜上形成商品化的固定干膠條，即IPG膠條。固定干膠條（immobiline
PHgradients,IPG）的概念：膠條由基質和聚丙稀酰胺形成一個整體，PH梯度的產生是由酸性和堿性基團與聚丙稀酰胺以梯度式共價鍵連接而形成。即使在電場中，它也是“固相”的。
圖-2固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質結合緩沖基團
2． [操作步驟]
1. 加樣品水化用水化液溶解樣品，一般18cm的膠條加水化液后的終體積是350μl。蛋白質上樣濃度不要超過10mg/ml，否則會造成蛋白質的集聚或沉淀。
2. 將溶解好的樣品加入放入標準型膠條槽中。
3. 從酸性端（尖端）一側剝去IPG膠條的保護膜，膠面朝下，先將IPG膠條尖端（陽性端）朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢壓下膠條，并前后移動，避免產生氣泡，最后放下IPG膠條平端（陰極），使水化液浸濕整個膠條，并確保膠條的兩端與槽的兩端的電極接觸。
4. IPG膠條上覆蓋適量 礦物油，蓋上蓋子。
5. 將標準型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸；膠條槽的平端背面電極與儀器的陰極平臺接觸。
6. 設置PGphor儀器運行參數：膠條水化的電壓，溫度和時間：等電聚焦電泳時的梯度電壓和溫度。
7. 暫時不進行第二向的IPG膠條可夾在兩層塑料薄膜中于—80℃保存幾個月。
3．[試劑準備]
1.水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG緩沖液）:
水化液需當天新鮮配制(可配成儲液分裝-20度保存，但不可反復凍融)。
2. IPG膠條
3. 礦物油
五 、 IPG膠條的平衡
1．[基本原理]
第一向電泳后蛋白質得到了初步分離，凝膠條中所含的蛋白質區帶，是第二向電泳的樣品，因此，進行第二向電泳前，要將第一向電泳后的凝膠條包埋在第二向電泳的凝膠板中。因為兩向電泳的分離系統不同，需將第一向電泳后的凝膠預先在第一向電泳分離系統中振蕩平衡，再包埋于第二向電泳凝膠板的電泳起始端，然后按照SDS-PAGE的方法進行電泳。
平衡液的體積隨膠條的長度而異。平衡的過程分為兩步：第一步平衡液的成分主要是Tris緩沖液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的主要作用是使第一向膠條上的蛋白質變性。平衡液中的尿素和甘油可以增加溶液的黏度，減少電內滲。電內滲作用是由固相化的兩性電解質造成的，它影響蛋白質從第一向到第二向轉移。SDS用于變性蛋白質，是蛋白質帶上負電荷，這對第二向SDS-PAGE來講是十分重要的。DTT是為了在蛋白質與SDS充分結合的同時，二硫鍵也得到還原；第二步的平衡液是用IAA（碘乙酰胺）代替DTT，這一步是用來烷基化自由DTT和蛋白質所帶的自由巰基，否則，自由DTT在二向遷移過程中會產生假條紋現象，在銀染后會觀察出來。兩次平衡的時間均為15分鐘。如果圖譜的豎直條紋太多則平衡時間可適當延長到20分鐘，時間太短時蛋白質沒有被SDS充分包裹，容易產生水平條紋。
2． [操作步驟]
1.使用前每10ml平衡緩沖液中加入100mgDTT ，取出IPG膠條分別放入平衡管中（支持膜貼著管壁，每個管中放入一根IPG膠條），在振蕩儀上平衡15min后倒掉平衡緩沖液。
2.每10ml平衡緩沖液中加入250mgIAA （碘乙酰胺），將膠條放入管中在振蕩儀上平衡15min后倒掉緩沖液。
3．[試劑準備]
1.平衡緩沖液 (0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v)
SDS)：180 g尿素, 150 g甘油, 10 g SDS和16.7 ml分離膠緩沖液溶于去離子水中，最終將
體積補足到500ml。此種緩沖液可于 室溫下保存兩周。
2. 溴酚藍溶液: 0.25% (w/v) 溴酚藍溶于分離膠緩沖液中 25 mg溴酚藍溶于10 ml 分離膠緩沖液中， 4°C儲存。
3.DTT
4.IAA