| 實驗步驟 | 一、第一向
1. 固相 pH 梯度凝膠或凝膠條的準備
固相 pH 梯度凝膠的灌注及聚合方法請參閱 固相 pH 梯度等電聚焦 有關章節，如需要可切成 3~5 mm 寬的膠條在 -20℃ 保存一年。為避免繁瑣和復雜的灌膠和切膠條程序和保證重復性，可從市場上購置凝膠條使用。市場上有不同長度和不同 pH 范圍的固相 pH 梯度凝膠干膠條可供選擇，長度最短為 7 cm，最長為 24 cm。pH 范圍有寬范圍，窄范圍和極窄范圍。GE 醫療集團、安瑪西亞公司在 pH 范圍方面有更多的選擇，見圖 8.4。凝膠條長度的選擇取決于第二向水平或垂直電泳槽的寬度，pH 范圍的選擇則取決于分辨率的要求和樣品的特性。
在一些 pH 范圍，凝膠條分為線性和非線性（non-linear, NL) pH 梯度兩種。前者是指 pH 梯度在凝膠中線性分布。后者是指在凝膠中的某一區間 pH 梯度的斜率小，因而在此區間的分辨率高，如圖 8.5 (b) pH 3~10 NL 中 pH 5~7 的三個斑點（橢圓中）比圖 8.5 (a) 的三個斑點要分得開。
2. IPG 凝膠干膠條的再水化（泡脹）
為了樣品等電聚焦的需要，作為雙向電泳第一向的固相 pH 梯度凝膠條中必須含尿素，去污劑，還原劑，載體兩性電解質等，不能長期保存，故按 固相 pH 梯度等電聚焦 制成的（或市售的固相 pH 梯度凝膠）干膠條必須用含有這些成分的水化溶液重新泡脹。
將在 -20℃ 保存的 IPG 干膠條在室溫平衡一段時間后，去掉保護膜。用新鮮配制的泡脹液重新水化凝膠。為保證凝膠的厚度和濃度，應將干膠條放在模具中泡脹過夜。
IPG 凝膠干膠條可以在室溫泡脹，也可以在電場（30V，20℃ ) 中泡脹。泡脹液中可以含樣品，也可以不含樣品，對不穩定樣品應采用后一種。泡脹至少需要 10 小時以上，建議在晚上進行。為防止泡脹液蒸發和尿素結晶，要在 IPG 凝膠干膠條上鋪一層覆蓋液（通常用硅油 )。具體操作方法請參閱儀器說明書。
泡脹液的組成取決于蛋白的溶解需要。通常含有尿素、非離子或兩性離子去污劑、還原劑，有時也含有 IPG 緩沖液（通常在含有樣品時泡脹應加 IPG 緩沖液 )。泡脹液的配制參見表8.2。
含有 IPG 緩沖液的泡脹液是在使用前按表 8.2 所述的泡脹液中加 IPG 緩沖液，終濃度為 0.5%~2%，所用 IPG 緩沖液的 pH 范圍與凝膠干膠條的 pH 范圍相同或盡可能相近。載體兩性電解質有時也可以代替 IPG 緩沖液。
3. 樣品制備
樣品制備是影響雙向電泳結果的主要因素之一。為了提高分析復雜蛋白混合物的分辨率，首先必須使感興趣的蛋白得到充分的溶解。對可溶蛋白的樣品，如血清，體液只需去除白蛋白和 IgG，再作簡單處理便可直接用于雙向電泳。對細胞，特別是組織，一般都需經過破碎、裂解、沉淀、溶解等多次處理才能上樣。裂解液和樣品液的組成見表 8.3。
樣品液與裂解液相似，但無需再加蛋白酶抑制劑。如需觀察，可加少許溴酚藍。通常要用 4 倍的樣品液溶解裂解后的樣品。如果樣品中有較多的鹽，則應用更高比例的樣品液溶解。對疏水蛋白等較難溶的蛋白可用 5 mol/L ( 或 7 mol/L ) 尿素，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，60 mol/L DTT，2% IPG 緩沖液（或載體兩性電解質 )。
2004 年在北京召開的第三屆人類蛋白質組學國際會議上，Gorg 題為 2D PAGE：Challenges for Proteome Analysis 的講座中提供了以下方法供參閱，見表 8.4 和表 8.5。
4. 等電聚焦
固相 pH 梯度等電聚焦的加樣方法有兩種。一種是在干膠條泡脹時將樣品加在泡脹液中，樣品濃度 5~10 mg/ml，樣品體積 350 ul (180 mm 膠條 )，450 μl ( 240 mm 膠條)。另一種是在等電聚焦前加樣品。樣品可加在樣品杯中，樣品濃度 5~10 mg/ml，樣品體積 20~100 ul，也可加在加樣濾紙塊上。用樣品杯加樣有利于堿性蛋白的分離，此時通常將樣品加在陽極。具體操作請參閱儀器說明書。
固相 pH 梯度等電聚焦時電參數的設置通常采用恒功率的方式。由于 IPG 凝膠條的離子強度低，因而聚焦過程中電流很小（往往小于 1 mA )。當蛋白質分子向等電點方向遷移時，電流也逐漸減小，此時為了提高分辨率，必須加大電壓。如采用恒功率電源，電壓便會自動上升，通常高至數千伏。凝膠條的長度 pH 范圍、樣品的組成、泡脹液的組成，上樣方式等都會影響電壓的升高，其中樣品中的鹽對電壓升高的影響最大。電壓越高，聚焦時間越短。過長的聚焦時間會導致拖尾和損失蛋白，這種現象稱為 過聚焦。
典型的等電聚焦程序有幾個步驟，如在電泳槽上泡脹干膠條，所需電壓很低 (幾十伏)。加樣時也采用低電壓（200~500V)，因為低電壓有利于樣品進入凝膠，并且能減少蛋白的聚合和相互作用。然后逐步分級升高電壓，直到達到預置的電壓（或伏·小時）并維持幾個小時。見表 8.6，表 8.7 和表 8.8。
等電聚焦后的凝膠條可以密封在塑料袋或試管中，貯存于 -80℃ 數月。
5. pH 梯度的測定
由于 IPG 凝膠介質的導電性很低，不能用表面電極測定，如需要可用雙向電泳蛋白標準在第二向電泳后測定。如果是寬 pH 范圍，也可以采用等電點蛋白標準在等電聚焦后測定。
6. 平衡
由于雙向電泳的第一向固相 pH 梯度等電聚焦后的樣品并沒有滿足第二向 SDS 電泳的條件，所以聚焦后的 IPG 凝膠條需要在平衡液中平衡。平衡分二步進行，先在含有 SDS、還原劑等但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡（振搖 10~15 分鐘)，以將蛋白解聚成多肽鏈，并包裹負電，再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡 ( 振搖 10~15 分鐘)，見表 8.9。碘乙酰胺的烷基化作用可保護 SH 基團，防止蛋白氧化，減少 紋理 （streaking ) 現象，得到清晰的圖譜，參見 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳。但平衡時間過長會丟失蛋白并使質譜分析復雜化。
平衡后用濾紙吸去多余的平衡液。將凝膠橫向豎立在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面。
二、第二向
1. SDS 電泳
參照 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳 配制合適的濃度梯度范圍的 SDS 凝膠。
因為 IPG 凝膠條聚合在支持膜上，所以如果第二向仍然是水平電泳，只要將膠面朝下貼于 SDS 凝膠的濃縮膠的膠面上（陰極側），避免氣泡陷入。為了提高分辨率，當溴酚藍前沿移出凝膠條 2 mm 時移去等電聚焦凝膠條，將陰極電極條移至凝膠條處后繼續 SDS 電泳。如果第二向是垂直電泳，要用瓊脂糖將凝膠條密封在濃縮膠上。先將瓊脂糖在 100℃ 融化，再待之降到 60℃ 時慢慢地將凝膠條固定，同樣要避免氣泡陷入。為了以后分子質量的測定，在 SDS 凝膠的一端加分子質量標準。SDS 電泳方法請參閱 SDS 聚丙酰胺凝膠電泳。
2. 檢測
考馬斯亮藍染色、銀染色、熒光標記、放射自顯影等方法均可用于雙向電泳的檢測，參見 常規聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS 聚丙酰胺凝膠電泳。
由于質譜檢測對蛋白質質量的要求（5 ug )，所以雖然考馬斯亮藍染色的靈敏度較低，但仍然不失為雙向電泳后常用的染色方法。
如果目標蛋白是低豐度蛋白，則應采用銀染色，銀染方法可參見 常規聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS 聚丙酰胺凝膠電泳，為了與質譜分析兼容，在敏化步驟中不加戊二醛，也不需要加甲醛，當然為此靈敏度有所降低，但也可檢測到 5 ng 的蛋白。
鋅-咪唑負染法檢測極限為 15 ng，與質譜兼容性好，但定量不準確。
放射自顯影和熒光成像是非常靈敏的檢測方法，可低至 200 fg。為了進行放射自顯影檢測，可用同位素標記，一般使用 35S、14C、3H 和 32P。電泳后凝膠簡單干燥，然后在 X 射線膠片或磷屏下曝光。熒光成像極其靈敏，凝膠電泳后與 PPO ( 2,4-diphenyloxazole ) 結合再檢測。
使用熒光染料如 SYPRO、deep purple、Cydye 等進行熒光標記來檢測不但靈敏度高，而且沒有放射性，是當前最佳檢測方法。特別是使用 Cydye 進行熒光差異分析簡化了染色程序，并且提高了靈敏度、準確性和重復性，與質譜兼容性好，定量動力學范圍寬。缺點是花費大，需要熒光掃描儀。
雙向電泳后也可以轉移到硝化纖維素膜或 PVDF 膜上以進行免疫化學檢測或序列測定。
理論上，一塊雙向電泳凝膠能分離出多達 15000 個蛋白斑點，實際上，到目前為止最多可得到 11000 個蛋白斑點。大多數實驗室到目前為止只能分離出幾千個蛋白斑點。縱然如此，想用肉眼來比較雙向電泳凝膠之間蛋白斑點的差異（新出現的斑點、斑點消失、位置變化、量的變化等）是不可能的。所以必須通過圖像掃描，存儲為圖像文件進行分析。掃描時應選擇合適的分辨率，大多 數情況下 300 dpi ( dot per inch) 比較合適。相對于凝膠而言，縮小的圖像會導致圖像質量的損失或無法分辨；而放大的圖像則會由于多余的像素而出現內插值 ( interpolated values)，甚至會出現 像素效應（pixellation)，影響測定。因此掃描時圖像與凝膠大小最好是 1:1，如果是考馬斯亮藍或銀染色，采用灰度透射模式掃描。
圖像分析軟件用于評價和量化電泳結果。在蛋白質組學研究中，圖像分析既要對上游各步的結果做出定性和定量的評價，將一個直觀的蛋白質雙向圖譜數字化，還要為下一步的分析提供依據。特別是在比較研究中，需要用圖像分析軟件通過對正常和異常細胞、組織等的電泳圖譜間的匹配，找出差異蛋白點，再結合圖像分析數據與內部和外部數據庫比較的結果做出結論。由此可見，雙向電泳圖像分析在蛋白質組學研究中是不可或缺的。
現在各大公司都有 2-DE 圖像分析軟件可供選擇，如 Gellab-Ⅱ、Kepler、 BioImage、Melanie、PDQuest、ImageMaster 2D Elite 等，自動化程度更高的 Z3 和 Progenesis 也已推出。圖像分析軟件雖然界面、算法和功能各異, 但是過程大致相同，包括點檢測、背景消減、匹配、分子質量與等電點校正、數據標準化等。
3. 蛋白斑點的后續分析
如果需要對圖像分析后感興趣的蛋白質進一步分析，首先要將這些蛋白斑點用人工或自動化儀器提取，然后進行酶解。現在有 4 種酶解方法將蛋白切成肽段：
(1) 凝膠內酶切（in gel Digestion)；
(2) 電洗脫后在溶液中酶切（electroelution and digestion in solution)；
(3) 電轉移到膜上后在膜上酶切（electrotransfer onto a membrane and cleavage on the membrane)；
(4) 在印跡過程中酶切（digestion during blotting)。
酶解后可以用基體輔助激光解析電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS) 測定凝膠內酶切后多肽混合物的質量，獲得肽質量指紋圖譜（Peptide mass fingerprinting，PMF)。這一方法中用質譜分析的是蛋白質被酶切后的多肽混合物，而不是分析蛋白質本身，因為電泳后凝膠上的蛋白質很難從凝膠上洗脫下來進行質譜分析，而且僅用蛋白質的分子質量在數據庫內檢索鑒別是很不充分的。與之相反，多肽容易從凝膠上洗脫下來，而且一個蛋白質被酶切后生成的一小組多肽的質量，能提供足夠的信息在數據庫檢索鑒定。近年來的研究進展顯示，從凝膠上切下數百個蛋白質的斑點，進行凝膠內酶切，用 MADLI-TOF-MS 測定 PMF，到最后數據檢索鑒定的整個過程，可以實現自動化，進行高通量的蛋白質組學研究。
蛋白質組學研究經典方法的步驟見圖 8.6。
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