1. 在干凈的1.5 mm 內徑的凝膠柱管上作好標記以指示應灌制凝膠柱的髙度。用橡皮筋將凝膠柱管捆綁成束，在一水平面上垂直豎起管束，從其頂部向下推壓，使各柱管的底部平齊。
2. 用三、四層Parafilm膜小心封好2.5~3.0 cm 內徑的凝膠灌制管的一端，使之形成一個結實的水密性的密封面。
3. 將凝膠柱管束放入凝校灌制管內，用環形支架和夾子將灌制管固定在垂直的位置，并使其密封端置于一水平面之上。 4. 加8.25 g 尿素、6.0 ml 水、2.0 ml 30%丙烯酰胺/1.8%亞甲雙丙烯酰胺、0.75 ml pH4~8的Ampholytes 兩性電解質于一個小的真空瓶中。瓶內加一小攪棒，將瓶子置于磁力攪拌器的溫水浴中，攪拌至尿素全溶于水，不要加熱使溶液溫度超過30℃。 5. 在強真空下脫氣2~3 min，加入0.3 ml NP-40，搖晃使之溶解混勻。
6. 將溶液倒入帶0.2或0.45 um 針頭式濾器的注射器中，推壓使之通過濾器。加入10 ul TEMED，搖勻；再加70 ul 過硫酸銨，搖勻。立即用吸管將溶液加入到凝膠柱管和大的凝膠灌制管之間的空間。
7. 用一洗瓶輕輕地在凝膠往管的外面加入水，直至將丙烯酰胺溶液壓進拄管至所設定的高度，放置使凝膠聚合。 8. 取去凝膠灌制管底部的Parafilm膜從底部將含有聚合好凝膠的凝膠管推出，用單刃刀片切去管子底部多余的丙烯酰胺。并在流動的去離子水下沖洗，除去殘余的丙烯酰胺。
9. 在每根管子的頂部套上橡皮扣眼，留意在扣眼下仍可看見凝膠的頂部，在扣眼上需留約5 mm 凝膠管。 10. 將凝膠管連同扣眼安裝在上緩沖液槽的孔眼中，多余的孔眼用橡皮塞子堵緊。 11. 往下緩沖液槽加入大約3 L 0.085%的磷酸。 12. 將上、下緩沖液槽安放在一起，調整下緩沖液槽使液面蓋沒凝膠。 13. 上緩沖液槽加入250 ml 0.02 mol/l 的NaOH，用帶22G皮下針頭的1 ml注射器將凝膠管的頂部用0.02 mol/l 的NaOH充滿，小心排去凝膠管中的所有氣泡。
14. 連接電源，黑色的導線接于上槽。在200 V 恒壓下預聚集1 h 撤開電泳槽與電源的連接。 15. 用50 ml 注射器將10~30 ul 蛋白質樣品穿過凝膠管上的緩沖液直接加在凝膠的表面。 16. 蓋上上槽蓋后，連接電源。打開電源調到設定電壓，恒壓電泳16 h。 17. 將電壓調到零位，關閉電源，結束電泳。用50 ul 注射器往毎根凝膠的頂部加入約1 ul 濃溴酚藍溶液。 18. 用一個裝上了 200 ul 移液器的吸頭的注射器,將凝膠用水壓從凝膠管中擠出。
19. 將凝膠放入作好標記的小瓶中，凝膠可立即使用或在-70℃放置數周。
20. 凝膠管在鉻酸冼液中浸泡過夜，在流動的去離子水中沖冼15 min。吸干管子中多余的水分，使之干燥。 展開 | 