第一向等電聚焦
⒈ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。
⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 對應膠條pH范圍的IPG buffer，充分混勻。
⒊ 從小管中取出400微升水化上樣緩沖液，加入100微升樣品（考馬斯亮藍染色需樣品1mg，銀染需300μg），充分混勻。
⒋ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預制膠條，室溫中放置10分鐘。
⒌ 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。
⒍ 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。
⒎ 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
⒏ 在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
⒐ 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
⒑聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE電泳
⒈ 裝配灌膠模具，配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配200ml凝膠溶液，每塊凝膠50ml，將溶液沿灌膠模具背面槽道倒入，直至溶液到距離玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘后，凝膠與上方液體分層，表明凝膠已基本聚合，建議聚合3-5h使凝膠完全聚合。
⒉ 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。
⒊ 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其恢復至室溫。
⒋ 配制膠條平衡緩沖液I（含DTT）。
5．在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
⒍ 將膠條轉移至平衡管或溶脹盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5-10ml膠條平衡緩沖液I。將平衡管或溶脹盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
⒎ 配制膠條平衡緩沖液Ⅱ（含碘乙酰胺）。
⒏ 第一次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液Ⅱ，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
⒐ 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。
⒑將低熔點瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
⒒將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
⒓第二次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液Ⅱ。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。
⒔將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。
⒕將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
⒖用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。
⒗放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
⒘在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。
⒙在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低功率（1W/gel/18-24cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（13-15W/gel/18-24cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
⒚電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。
⒛進行染色。