實驗概要
夾心 ELISA 法是應用兩種抗體協同測定抗原含量的方法（即：捕獲抗體和檢測抗體）。因此抗原必須包含至少 2 個能被抗體識別的抗原位點。在夾心 ELISA 中，單克隆抗體和多克隆抗體都可以被用作捕獲抗體和檢測抗體。單抗識別單一的抗原表位，可以區別抗原的微小差別，使抗原得到更精確地檢測和定量。多克隆抗體通常被用作捕獲抗體，以捕獲盡可能多的抗原。
夾心 ELISA 的優勢是樣品在分析前不需要純化，檢測靈敏度高（靈敏度是直接法或間接法的 2-5 倍）。
實驗步驟
1. 包被捕獲抗體
1) 用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH 7.4) 稀釋捕獲抗體至濃度 1-10 μg/ml，包被酶標板。
2) 封口膜覆蓋酶標板，于 4 °C 孵育過夜。
3) 倒掉包被液，用磷 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。
2. 封閉和加樣品
1) 封閉包被后孔內殘留的蛋白結合位點,每孔加 200 μl 含 5% 脫脂奶粉的 PBS 的封閉液。
2) 封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育至少 1-2 小時，或者方便的話 4 °C 孵育過夜。
3) 每孔加 100 μl 適當稀釋的樣品。在精確定量測定時，通常將未知濃度樣品與標準曲線相比較，每塊板都要做標準（做兩份或者三份）和空白對照以保證精確性。37 °C 孵育 90 分鐘。
4) 倒掉樣品，PBS 洗板 2 次，每孔用 200 μl。
3. 用檢測抗體和二抗先后進行孵育
1) 每孔加入 100 μl 稀釋好的檢測抗體。
2) 封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育 2 小時。
3) PBS 洗板 4 次。
4) 加入標記二抗，每孔 100 μl，使用前用封閉液快速稀釋至最佳濃度（參照使用手冊）。
5) 封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育 1-2 小時。
6) PBS 洗板 4 次。
4. 檢測
使用多通道移液器加入底物溶液，每孔 100 μl（或 50 μl）。