第三階段 陽性相互作用的再次確定
材料
緩沖液和溶液
乙酸銨（7.5 ml/L)
氯仿
乙醇
異丙醇
裂解液
酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救緩沖液中或β-葡糖醛酸酶 100000 單位/ml(Sigma）按 1:50 稀釋于拯救緩沖液中每次使用均需配置新鮮的溶液。
酚（早衡至 pH8.0)
拯救緩沖液
50 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/LEDTA
0.3%β-巰基乙醇
每次使用均需配置新鮮的溶液。
SDS(10%,m/V)
STES 裂解液
100 mmol/LNaCl
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS
TE(pH8.0)
酶和緩沖液
限制性內切核酸酶 Eco RI，XtoⅠ，Hae Ⅲ
凝膠
瓊脂糖凝膠
請參見步驟 5。
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，并根據表 18-9 制備所需的選擇培養基。
無氨基酸的酵母氮源（YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-9 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它就不含有硫酸銨，配制時毎升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
細菌基本培養基（色氨酸缺乏）
制備下列高壓滅菌貯存液：
1.20%(m/V）硫酸鎂
2.4 mg/ml 尿嘧啶
3.4 mg/ml 組氨脧
4.4 mg/ml 亮氨酸
5.20%(m/V) 葡萄糖
制備下列過濾除菌溶液：
6.50 mg/ml 芐青霉素
7.1% 鹽酸硫胺素
分別高壓滅菌下列兩種溶液：
8.15 g 瓊脂溶解于 800 ml 蒸餾水中
9.10.5 g 磷酸氫二鉀
4.5 g 磷酸二氫鉀
1 g 硫酸銨
0.5 g 檸檬酸鈉
160 ml 蒸餾水
將溶液 8 和 9 冷卻至 50°C，混合。迅速加入 1 ml 的溶液 1.10 ml 的溶液 2，10 ml 的溶液 3，10 ml 的溶液 4,10 ml 的溶液 5,lml 的溶液 6，以及 0.5 ml 的溶液 7。徹底混合終溶液，馬上倒制平板。
酵母選擇 X-gal 培養基
i. 按照表 18-9 所述，在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C
ii. 在另外一個瓶子中，7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中, 高壓滅菌。
iii. 把兩種高壓滅菌溶液混合在一起，加入濃度為 100 mg/ml 的 X-gal 溶液（溶于 N,N-二甲基甲酰胺）0.8 ml, 倒制平板。
離心機和轉子
Sorvall RT6000 離心機，H1000B MPC 和 H6000A MPC 轉子（離心微量滴定板用）
專用設備
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可選])
重復用移液管
可選，請參見步驟 1。
附加試劑
此方案的步驟 2 需要第 1 章方案 26 中列出的電穿孔試剤。
此方案的步驟 3 和 4 需要第 1 章方案 1 中列出的小量質粒 DNA 制備用試劑。
此方案中步驟 10 需要第 4 章方案 13 中列出的酵母 DNA 測序試劑。