第二階段 篩選一個相互作用子
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋至適當的濃度
二甲基亞砜（DMSO)
乙醇
可選擇，請參見步驟 9。
凍存轉化體用的無菌甘油溶液
65% 無菌甘油
0.1mol/LMgS04
25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（無菌）
TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸鋰
TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸鋰（無菌）
核酸和寡聚核苷酸
載體 DNA
剪切處理的鮭精 DNA 為典型的常用載體。髙質量的 DNA 是非常重要的。使用低質量的制品可能降低 1~2 個數量級的轉化頻率。生產髙質量鮭精 DNA 的簡便方法請參見 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可選擇許多公司出售的這種商品。
相互作用篩選文庫
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，根據表 18-8 制備所需的選擇培養
無氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸銨，配制時每升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
酵母選擇 X-gal 培養基
1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C。
2. 在另一個瓶于中，將 7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中，高壓滅菌。
3. 將兩種髙壓滅菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 濃度為 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 鋪制平板。
離心機和轉子
Sorvall GSA 轉子或等同物
Sorall RT6000 離心機和 H1000B 轉子或等同物
專用設備
選擇培養基用培養極（24 cmX24 cm)(見表 18-3)
這些培養板非常昂貴，但是可以重復使用很多次（見步驟 9)。
Falcon 管（50 ml，無菌）
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
可選，請見步驟 9。
加熱塊，預設至 42°C
微量滴定板（96 孔）
可進，請參見步驟 21。
多道移液器或接種多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)
可選，請參見步驟 21。
用于多菌落轉移的蛙形器可以購買或自己制造也很容易；蛙形器的所有輻條都有一個平坦的表面且輻條末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通過高壓或乙醇灼燒來滅菌。
載體和細菌菌株或酵母菌株
攜帶表達誘餌蛋白質和 lexAop/lacZ 報道子的載體的釀酒酵母候選菌株（來自第—階段）。
方法
轉化文庫
1. 挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子的酵母菌落，接種于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，30°C 搖動過夜培養。
重要：應該在用文庫重新轉化之前 7~10d 內，將誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子質粒轉化到酵母中。在整個試驗過程中始終保持無菌條件非常重要。
2. 稀釋 20 ml 的過夜培養物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，以使稀釋后培養液的 OD600 約為 0.10~0.15。在旋轉搖床上 30°C 搖動培養，直到該培養物增殖 1~5 倍，OD600 達到 0.50 左右。
3. 把培養物轉移至 1 個 250 ml 的無菌離心瓶中，室溫下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子 2500~3000r/min) 離心 5 min。移去上清，加入 30 ml 無菌水，在工作臺上輕輕拍打離心瓶重新懸浮沉淀，轉移混合物至 1 個 50 ml 的無菌 Falcon 管中。
4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子 2500~3000r/min) 離心酵母細胞 5 min。倒掉水，重新懸浮酵母細胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸鋰的 TE(pH7.5) 中。
5. 在 30 個 1.5 ml 的無菌小離心管中分別加入 1ug 的文庫 DNA 和 50ug 剛剛變性的載體 DNA。馬上在每個小離心管中加入 50ul 的酵母懸浮液（來自步驟 4)。
—個成功的轉化試驗，每微克文庫 DNA 應該產生約 105 個轉化子。使用小體積的 DNA(最好毎個轉化管中少于 10ul) 通常可以提高轉化效率。
平行地進行多份小量的酵母轉化有利于喊少污染的概率，而且這種方法與在較少試管中采用較大體積相比，經常可以得到顯著更髙的轉化效率。每份感受態酵母細胞懸泮液中不要加入過多的轉化文庫 DNA, 否則每個感受態細胞可能吸收多個文庫質粒，使后面的分析復雜化。
6. 在每管細胞懸浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸鋰的無菌 TE(PH7.5), 輕輕翻轉試管若干次使混合（不要振蕩)，30°C 培養 30~60 min。
7. 每個試管中加入 40ul DMSO, 翻轉混勻懸浮液，在 42°C 的加熱塊上加熱 10min。
8. 按照下述步驟將轉化混合物鋪平板：
其中的 28 管只用于產生轉化子
a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 選擇平板上。