雙雜交和其他雙成分系統實驗(一)

發布時間：2019-03-25 22:18 原文鏈接：雙雜交和其他雙成分系統實驗(一)

實驗材料	載體和酵母菌
試劑、試劑盒	緩沖液和溶液 SDS 凝膠上樣緩沖液 SDS 聚丙烯酰胺凝膠核酸和寡核苷酸抗體培養基
儀器、耗材	專用設備
實驗步驟	第一階段誘餌-LexA 融合蛋白的鑒定材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到適當濃度。 2XSDS 凝膠上樣緩沖液 100 mmol/L Tris-Cl(pH6.8) 200 mmol/L 二硫蘇糖醇 4%SDS(電泳級） 0.2% 溴酚藍 20% 甘油不含二硫蘇糖醇的 SDS 凝膠上樣緩沖液可在室溫存放。緩沖液用前在 1mol/L 貯存液中加入二硫蘇糖醇。凝膠 SDS 聚丙烯酰胺凝膠制備蛋白質分離用的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠，請見附錄 18。核酸和寡核苷酸編碼目標蛋白（誘餌）的靶 DNA 抗體抗 LexA 的單克隆抗體（CLONTECH) 或抗 LexA 的多克隆抗體（Invitrogen) 或抗靶蛋白質融合域的特異性抗體（如果有的話）。培養基酵母培養基的成分請見附錄 2。 CM 選擇性培養基用表 18-3 估計褥要培養基的量，用表 18-4 制備必需的選擇性培養基。商品銷售的無氧基酸的酵母氮源（YNB) 有含硫酸胺和不含硫酸胺兩種。表 18-4 假定 YNB 含硫酸胺。如杲盛酵母氮源的瓶子上指示加 1.7 g/L 來配置培養基, 它就不含有硫酸胺，應當在每升培養基中加 5 g 硫酸胺。酵母選擇性 X-gal 培養基 1. 按表 18-4, 以 900 ml 水制備基礎培養基。將基本培養基高壓滅菌并冷卻到 55°C。 2. 在另一個瓶子中，以 100 ml 蒸餾水溶解 7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉，然后髙壓菌。 3. 將兩種高壓滅菌的溶液混合在一起，并加入 0.8 ml 濃度為 100 mg/ml 的 X-gal(在 N,N-二甲基甲酰胺中), 鋪平板。 YPD 培養基 20 g 蛋白胨 10 g 酵母提取物 20 g 葡萄糖 20 g 瓊脂（如果用于平板）加 1L 蒸餾水并高壓 20 min。鋪板前將高壓滅菌的培養基冷卻到 55C。專用設備干冰/乙醇浴鍋請見步驟 13。平頭牙簽，滅菌的滅菌時，將標準牙簽轉移到 250 ml 燒杯中，用鋁鉑紙包蓋燒杯，在標準干燥條件下高壓滅菌。預設到 100°C 的加熱包或熱循環儀，或沸水浴。附加試劑本方案第 1 步需要亞克隆試劑，列在第 1 章方案 17。本方案第 2 步需要酵母轉化試劑，列在 Spector 等的文獻中（1998, 第 21 章）。本方案第 17 步需要免疫印跡試劑，列在附錄 8。載體和酵母菌選擇和擴增載體用的釀酒酵母菌（請見表 18-6) 帶 LexA(請見表 18-1) 和活化域融合序列（請見表 18-2) 的載體，以及 LacZ 報道子質粒（請見表 18-5)。

方法

誘餌-LexA 融合蛋白的構建

1.將編碼誘餌蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合載體（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接頭處，以合成一種框架內的 LexA 融合基因。確定誘餌序列的羧基端存在翻譯終止序列。形成的質粒作為 pBait。

2. 采用下列 LexA 融合基因和報道質粒的組合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 選擇的轉化酵母菌：

a.pBait+pMW112(活化測定）

b.pSH17-4+pMW112(活化的陽性對照）

c.pRFHMl+PMW112(活化的陰性對照）

d.pBait+pJK101(抑制/DNA 結合測定）

e.pRFHMl+pJK101(抑制的陽性對照）

f.pJK101單獨（抑制的陰性對照）

每種質粒功能的描述，請見表 18-1 和 18-2。

3. 將每種轉化混合物鋪在適宜的選擇性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(針對質粒組合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(針對質粒組合 f)。將培養板在 37°C 培養 2~3d 以選擇含有質粒的轉化酵母克隆。
如果克隆在 3~4d 內沒有出現，或只有很少量的克隆（<20), 則應重新轉化。

4. 制備轉化子的母板，從中可按步驟 5~9 描述的那樣，對具有 lacZ 和 LEU2 報道子活化表型的特異性克隆進行分析。

活化和抑制活性的鑒定：X-gal 和 Leu2 表型的分析

步驟 5~9 用于測試誘餌-LexA 融合蛋白質的轉錄激活性，并證實誘餌的融合物不影響 DNA 結合活性（抑制分析的圖示請見圖 18-9)。對步驟 2 中轉化的每種質粒組合，挑選幾種單個克隆做分析。這對于某些誘餌的構建非常重要，因為蛋白質表達水平在不同克隆中會有變化，正如活化兩種報道子轉錄激活的表觀能力有變化一祥。在第一階段結束處的替代方案中，給出了一種替代步驟 5~8 的、通過氯仿交疊分析來測試活化的方法。

5. 從 a~f 的每個轉化（取自步驟 2) 中，用無菌的平頭牙簽挑選約 8 個克隆。用干凈的牙簽觸及克隆以挑取細胞，使它們在新鮮的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格內成為 lcm 長的線。通常可在一個板上形成多達 60~80 條線。將平板在 30°C 孵育過夜。

6.第二天，從兩個母板中再劃線到下列每個板上：
轉化 a~f: 劃線到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上
轉化 a~c: 劃線到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上

7. 在 30°C 將平板孵育到 4d。

8. 對抑制和激活性進行分析；

a. 對于抑制活性，在劃線接菌約 12~24 h 時觀察 X-gal 表型。

b. 對于激活性，在劃線接菌 18 h 到 72 h 之間觀察 X-gal 表型。

c. 在 48 h 到 96 h 之間觀察 Leu2 表型。在表 18-7 中給出了具有良好表現的誘餌所應得的預期結果，并總結如下。
（1）最好在接種到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 應當能看出 d+e 轉化比 f 的顏色淺。
在接種到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 轉化應當是亮藍色,c 應當是白色，而 a 應當是白或很淡的藍色。
（2）在接種后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 轉化應當同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一樣很好生長，而 a 和 c 應當不生長。
（3）最理想的是,a 轉化在接種后 96 h 內仍沒有明顯的生長。

9.基于抑制和激活分析的結果，選擇適當的候選克隆。

檢測誘餌蛋白質表達

10. 在母板上，標記要分析蛋白質表達的克隆。用已證實適宜表達誘餌的克隆作為基礎菌培養，供文庫轉化用（在第二階段中）。

11. 對每個新的誘餌構建，至少分析兩個初級轉化子。還要包括兩個作為蛋白質表達陽性對照的轉化子（如 pRFHMI)。

a. 用無菌牙簽從 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液體培養基中生長。如果帶手套，牙簽可落入培養管并留在那里，不用擔心污染。
b. 在滾筒或其他搖動儀器上 30°C 培養過夜。
c. 早晨，將達飽和的培養液稀釋到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培養管中，使初始密度 OD₆₀₀ 約為 0.15。30°C 培養 4~6 h, 直到光密度大約增大兩倍（OD₆₀₀約 0.45~0.7)。

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