方法
轉化文庫
1. 挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子的酵母菌落，接種于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，30°C 搖動過夜培養。
重要：應該在用文庫重新轉化之前 7~10d 內，將誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子質粒轉化到酵母中。在整個試驗過程中始終保持無菌條件非常重要。
2. 稀釋 20 ml 的過夜培養物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，以使稀釋后培養液的 OD600 約為 0.10~0.15。在旋轉搖床上 30°C 搖動培養，直到該培養物增殖 1~5 倍，OD600 達到 0.50 左右。
3. 把培養物轉移至 1 個 250 ml 的無菌離心瓶中，室溫下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子 2500~3000r/min) 離心 5 min。移去上清，加入 30 ml 無菌水，在工作臺上輕輕拍打離心瓶重新懸浮沉淀，轉移混合物至 1 個 50 ml 的無菌 Falcon 管中。
4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子 2500~3000r/min) 離心酵母細胞 5 min。倒掉水，重新懸浮酵母細胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸鋰的 TE(pH7.5) 中。
5. 在 30 個 1.5 ml 的無菌小離心管中分別加入 1ug 的文庫 DNA 和 50ug 剛剛變性的載體 DNA。馬上在每個小離心管中加入 50ul 的酵母懸浮液（來自步驟 4)。
—個成功的轉化試驗，每微克文庫 DNA 應該產生約 105 個轉化子。使用小體積的 DNA(最好毎個轉化管中少于 10ul) 通常可以提高轉化效率。
平行地進行多份小量的酵母轉化有利于喊少污染的概率，而且這種方法與在較少試管中采用較大體積相比，經常可以得到顯著更髙的轉化效率。每份感受態酵母細胞懸泮液中不要加入過多的轉化文庫 DNA, 否則每個感受態細胞可能吸收多個文庫質粒，使后面的分析復雜化。
6. 在每管細胞懸浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸鋰的無菌 TE(PH7.5), 輕輕翻轉試管若干次使混合（不要振蕩)，30°C 培養 30~60 min。
7. 每個試管中加入 40ul DMSO, 翻轉混勻懸浮液，在 42°C 的加熱塊上加熱 10min。
8. 按照下述步驟將轉化混合物鋪平板：
其中的 28 管只用于產生轉化子
a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 選擇平板上。
b. 將細胞涂勻，并將平板置于 30°C 孵育直到菌落出現。
每個 24 cmX24 cm 平板需要 250~300 ml 的培養基，應該在倒制平板后室溫干燥 1~2d 再使用。為了減少污染的機會，倒制平板后需用火烘烤平板表面。一些研究人員采取了另外的處理方法：打開平板，翻轉蓋子放置在標準組織培養超凈臺內，紫外線照射約 10 min。
剩余 2 管用來評價轉化效率
a. 從每個管中取 350ul 混合物加卻 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平扳上。
b. 鋪平細胞，30°C 培養平板直到菌落出現。
c. 吸取每管中剩余的 40ul 混合物用無菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1:10 稀釋（至少 3 次)。
d. 每份稀釋液吸取 100ul 鋪在 100 mmCM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 培養平板直到菌落出現。
分析稀釋度能夠大致估計所得轉化子的數目。100 mm 指示平扳上預測增加的轉化子菌落數目偶爾與 24 cmX24 cm 平板上的數目有顯著的不同，尤其是不同批次的平扳之間。一個成功的轉化實驗中每個大平板上應該產生 20000~40000 個菌落。
初級轉化子的收獲和富集
步驟 9~14 提供代表全套初級轉化子的凍存物，可用于后面的篩選。在這個實驗中，從初級轉化子（約 106 個細胞）制備同質的細胞懸液，每一份都可以用來在選擇培養基上進行平板篩選。這項技術代表了更加常規的轉移酵母的方法（例如：復制平板培養），它轉移了如此大量的細胞，以至于在選擇培養基上可以觀察到某種程度上導致虛假背景的細胞生長。如果在平板上觀察到可見的霉菌斑或其他的污染，那么在收獲文庫轉化子之前，用無菌刀片小心地切去污染物及其周圍部分。
在步驟 9 中，第一種方法（揺動法）操作起來很快，可以在同一天進行文庫的誘導和選擇培養基上的篩選，它也縮短了平板打開的時間，從而避免源于空氣傳播的霉菌和細菌的污染。大約三分之一的酵母細胞懸浮液將留在平板上；然而正常情況下所使用的量不超過收集懸液的 2%，所以保證酵母菌落以大致相等的概率從平板上洗脫是很重要的。步驟 9 中的第二種方法（刮擦法）節省試劑，而且可以方便地在已經切掉霉菌和污染物的平板上使用。
9. 使用下列方法之一收獲文庫。
1) 通過搖動法收獲文庫
a. 分別在 5 個含有轉化子的 24 cmX24 cm 平板上倒入 10 ml 無菌水和大約 30 粒無菌玻璃珠。
b. 把 5 個平板疊放在一起，緊握平板，猛烈地搖動平板直至菌落重新懸浮（1~2 min)
c. 用無菌移液管從每個平板中吸取 5 ml 酵母懸液（傾斜平板) 把細胞懸液集中在 50 ml 的無菌錐形管中。
d. 繼續下面的 5 個平板，重復步驟 a~c。連續從 30 個平板中收獲酵母細胞，結果得到總體積為 150 ml 的酵母懸液，保存在 3 個 50 ml 管中。
相同的玻璃珠可以轉移到新的平板中，也可使用新的玻璃珠。同時洗脫的平板可以超過 5 個，只要手可以握住搖動即可。
平板可以重復使用許多次。收獲酵母細胞后，棄去殘余的瓊脂，沖洗平板，用乙醇擦拭，暴露于紫外燈下照射 10 min, 存儲備用。
2) 通過刮擦法收獲文庫
a. 戴著手套，把 30 個含有轉化體的 24 cmX24 cm 平板放在 4°C 環境中使瓊脂變硬（通常需要 2 h 甚至過夜）。
b. 把一個顯微鏡載玻片在乙醇中浸泡，然后灼燒消毒，用這個玻片輕輕地把酵母細胞從轉化平板上刮至 50 ml 的錐形管中。不斷地重新灼燒玻片或換用新的玻片（每 5~10 個平板)。
全部 30 個平板上的細胞通常匯集在一或兩個 50 ml 錐形管中。
平板可以重復使用許多次。收獲酵母細胞后棄去殘余的瓊脂，沖洗平板，乙醇擦拭，暴露于紫外燈下照射 10 min，存儲備用。
10. 如果需要，在每個裝有酵母細胞的錐形管中加無菌 TE(pH7.5) 或無菌水至 40~45 ml, 振蕩或翻轉試管懸浮細胞。
11. 使用臺式離心機 1000~1500 g(使用 Sorvall H1000B 轉子 2200~2700r/min) 室溫下離心試管 5 min, 棄去上清。
12. 重復步驟 10 和 11。
第二輪洗滌后，源自 1.5X106 個轉化體的細胞沉淀總體積應為 25 ml。
13. 重新懸浮緊的細胞沉淀于一倍體積的無菌甘油溶液中，合并不同管的內容物，徹底混合。
14. 分別轉移1ml 的細胞混合物于一系列無菌小離心管中，-70°C 凍存（至少 1 年內細胞保持穩定）。
如果直接在選擇培養基上進行平板培養（完成需要 5 h)，留一份不要凍存，進行下面的步驟。假設未凍存培養物的存活力 100%,—般情況下，酵母凍存時間少于一年，預期存活力將大于 90%。如果出現意外情況（例如：特別是在選擇培養基上鋪平板培養凍存細胞后沒有得到菌落)，通過在 CM(GlU)-Trp-His-Ura 上進行一系列的有限稀釋測量凍存細胞的存活力。
相互作用蛋白的篩選
轉化文庫的每一份鋪在亮氨酸缺乏的選擇培養基上來檢測其能否促進 LEU2 轉錄。并不是所有含有相互作用蛋白質的細胞在亮氨酸缺乏的選擇性培養基平板上都以 100% 的效率生長（Estojaketal.1995)。為了增加檢測到相互作用的概率，轉化文庫中獲得的每一個克隆都應該在選擇培養平板上出現 3~10 個能存活的酵母細胞。例如：最初得到 5x105 個克隆，1.5x106~5x106 個細胞就應該涂布在 2~5 塊平板上。雖然這樣操作可能導致過多地分離到相同的 cDNA, 但是它幫助我們保證了所有的初級轉化子在選擇培養基平板上至少呈現 1 個細胞。事實上，在一批相對較少的陽性克隆中，一條相同的 cDNA 的重復分離可被看作為一個特殊蛋白質間相互作用的標志。
15. 解凍一份轉化文庫酵母細胞（來自步驟 14)， 用 CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp 培養基按 1:10 稀釋，30°C 搖動培養酵母細胞 4 h 來誘導文庫中 GAL1 啟動子的轉錄。
16. 在適當數量的 100 mm CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp-Leu dropout 平板上分別培養 106 個細胞（或 50ul OD600 為 1.0 的培養物）。
重要：每個平板 105 個細胞為通常有效使用的最髙平板密度。更髙密度平板培養（例如：3X106。可能產生酵母細胞間的共棲現象，導致很高的背景生長。
17.30°C 培養平板 5d。
決定于所使用的單個誘餌蛋白，好的陽性相互作用單元候選菌通常在 5d 內長出克隆，大多數克隆在 4d 間出現。
18. 觀察平板的生長，出現克隆時對其加以標記。
一個好的策略（特別每生長出大量克隆時）是每天現察平板，并不需要馬上挑取克隆。而是第一天肉眼可以看到的充隆用實驗室記號筆以一個特定顔色的點在平板上標記它們的位置（例如：第 3 天為紅色）。每一天以不同的顏色筆標記剛剛長出的克隆（第 4 天為藍色等）。
19. 第五天，形成一個按每天出現的不同克隆分組的主板 (CM[Glu]-Ura-His-Trp)。如果出現許多明顯的陽性克隆，就有必要按照第二天、第三天和第四天出現的克隆分別生成一些單個的平板。為了為后面的步驟制作一個陰性對照，從檢測酵母細胞存活力的平板上隨機挑取 3~5 個克隆（請參見步驟 14 的說明），在測試主板上平行劃線培養。如果在后面的實驗步驟中使用多支管/蛙形器，要確信在合適的方格網中劃線以保證菌落與蛙形器上的輻條相對應（請參見圖 18-10)。
20.30°C 孵育平板直到斑點/菌落形成。
陽性相互作用的初次確定：β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的檢測步驟 21 和 22 檢測 lexAop-LEU2 和 lexAop-lacZ 報道基因的半乳糖誘導的轉錄活化。兩個報道甚因在半乳糖特異誘導的條件下同時表達，表明這種轉錄表型的出現是因為文庫編碼蛋白質的表達，而不是酵母宿主菌的突變。含有葡萄糖和亮氨酸的母板可用來提供檢測克隆。