21. 測定轉錄活化。
這個實驗可以利用牙簽重新劃線培養或利用多支管/蛙形器來進行，在分析大量陽性克隆時，多支管/蛙形器是非常有用的（有關蛙形器的詳細情況請參見圖 18-10)。
1) 通過直接劃線培養測定
a. 使用一個平頭牙簽分別在下面的 4 個平板上復制和主板上相同的柵格。使用相同的牙簽在四個平板上劃線培養單克隆，盡量在含有 X-gal 平板上劃制粗的酵母線條，而在亮氨酸缺乏的平板上劃制細的酵母線條。
CM(Glu/X-gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu/Raff/X-gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
CM(Glu/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
b. 平板在 30°C 培養 3~4d。
X-gal 平板在 48 h 之內即會產生結果，最強的相互作用甚至 18 h 就會長出斑點。48 h 到 72 h 之間亮氨酸平板上不同的生長狀況通常很明顯。
2) 使用多支管/蛙形器測定
a. 在 96 孔微量滴定板上的 48 個孔中加入 25~30ul 無菌水。
b. 使用蛙形器從預先畫好柵格的主板上將菌斑同時轉移至微暈滴定板的孔中。輕輕搖動滴定板。
c. 再次使用蛙形器從微量滴定板中將酵母轉移至下面的平板上。這種方法可以把大致相同數量的細胞轉移到同一塊平板上。
CM(Glu)-Ura-His-Trp 2 個平板
CM(Gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
d. 平板在 30°C 培養 3~4d。平板在培養 1d 后，采用氯仿覆蓋法（請參見第一階段結束處的替代方案：“通過氯仿覆蓋分析屮半乳糖苷酶活性”)，使用一個 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板和一個 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板測定 lacZ 報道基因的活化。
e. 繼續監控菌斑的生長：通常在 48 h 到 72 h 之間，在亮氨酸平板上的生長與在亮氨酸缺乏平板上的生長將產生明顯的不同。第二塊 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板可作為新的主板。
22. 解釋結果。如果具備下面的條件，菌落和它們包含的質粒被認作為第一輪的陽性充隆：
(1) 在 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板上的培養物 X-gal 分析呈現藍色。
(2) 在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上的培養物 X-gal 分析呈現白色或僅是淺藍色。
(3) 菌落在 CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生長良好。
(4) 菌落在 CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生長緩慢或根本不能生長。
第三階段 陽性相互作用的再次確定
材料
緩沖液和溶液
乙酸銨（7.5 ml/L)
氯仿
乙醇
異丙醇
裂解液
酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救緩沖液中或β-葡糖醛酸酶 100000 單位/ml(Sigma）按 1:50 稀釋于拯救緩沖液中每次使用均需配置新鮮的溶液。
酚（早衡至 pH8.0)
拯救緩沖液
50 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/LEDTA
0.3%β-巰基乙醇
每次使用均需配置新鮮的溶液。
SDS(10%,m/V)
STES 裂解液
100 mmol/LNaCl
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS
TE(pH8.0)
酶和緩沖液
限制性內切核酸酶 Eco RI，XtoⅠ，Hae Ⅲ
凝膠
瓊脂糖凝膠
請參見步驟 5。
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，并根據表 18-9 制備所需的選擇培養基。
無氨基酸的酵母氮源（YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-9 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它就不含有硫酸銨，配制時毎升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
細菌基本培養基（色氨酸缺乏）
制備下列高壓滅菌貯存液：
1.20%(m/V）硫酸鎂
2.4 mg/ml 尿嘧啶
3.4 mg/ml 組氨脧
4.4 mg/ml 亮氨酸
5.20%(m/V) 葡萄糖
制備下列過濾除菌溶液：
6.50 mg/ml 芐青霉素
7.1% 鹽酸硫胺素
分別高壓滅菌下列兩種溶液：
8.15 g 瓊脂溶解于 800 ml 蒸餾水中
9.10.5 g 磷酸氫二鉀
4.5 g 磷酸二氫鉀
1 g 硫酸銨
0.5 g 檸檬酸鈉
160 ml 蒸餾水
將溶液 8 和 9 冷卻至 50°C，混合。迅速加入 1 ml 的溶液 1.10 ml 的溶液 2，10 ml 的溶液 3，10 ml 的溶液 4,10 ml 的溶液 5,lml 的溶液 6，以及 0.5 ml 的溶液 7。徹底混合終溶液，馬上倒制平板。
酵母選擇 X-gal 培養基
i. 按照表 18-9 所述，在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C
ii. 在另外一個瓶子中，7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中, 高壓滅菌。
iii. 把兩種高壓滅菌溶液混合在一起，加入濃度為 100 mg/ml 的 X-gal 溶液（溶于 N,N-二甲基甲酰胺）0.8 ml, 倒制平板。