雙標簽的分離實驗

溶液與緩沖液 BSA LoTE cDNA標簽

一、用 NlaIII 消化雙標簽，釋放接頭

1.向 480ul 已純化的 PCR 產物中加入下列成分：

2.在 37℃ 下消化 Ih(不要熱失活酶，否則將致使 22~26bp 的小雙標簽變性)。

3.消化產物可以在 4℃ 下過夜保存，或者用 Dynabead 進行生物素化 PCR 產物的提取。

二、用 Dynabead 提取生物素化產物

注意：本步驟中，由于生物素鏈霉抗生物素的捕獲，去除了接頭及未酶解或者部分酶解的產物，從而富集反應產物。

1.蕩鏈霉抗生物素 M-280 Dynabead 1 min，使其重新成為懸液。

2.將 3 份 IOOul 的 Dynabead 轉移入 1.5 ml 的 Eppendorf 試管中。

3.用磁設備固定磁珠，棄去上清液。

4.200ulIX 結合及沖洗緩沖液重懸沖洗 3 次，固定磁珠，棄去沖洗液。

5.NlaIII 酶解過的雙標簽（體積為 600ul) 分為 200ul 的三份；向三份沖洗過的磁珠中每份加入 200ul。

6.混勻后，在室溫下孵育 30 min(每 IOmin 混合 1 次)。

7.用磁設備固定磁珠，并將上清液移入一新的 1.5 ml 的 Eppendorf 試管中。

8.為使上清液發生沉淀，需加入：

一 3ul 糖原

一 800ul 乙醇

9.在干冰/乙醇上冰浴 15 min。

10.在 4℃ 下，以 13000r/rnin 在微量離心機中離心 15 min。

11.乙醇洗滌沉淀 1 次，自然風干。

12.新使其懸浮于 30ul 以的 LoTE 中。

13.將全部樣本上取樣于 8 道的 I2% 的聚丙烯酰胺凝膠上，用 IObpladder 作為分子量標準（注意：我們推薦用含有橙黃 G 的上樣緩沖液，可防止和 22~26bp 雙標簽的共同移動)。

14.室溫、50V 電壓下，進行凝膠電泳 2.5 h, 或者直到澄黃 G 在凝膠的底部為止。

15.EB 染色。

16.凝股上切除雙標簽帶，此帶為 22~26bp(圖 2-5), 應在士 40bp 的接頭的下面。

17.用 4 個 0.5 mlPCR 試管分裝切下的聚丙烯酰胺凝膠片段，各小試管均用 21 號針頭在底部穿有小孔。將 PCR 試管放入一個 1.5 ml 的 Eppendorf 試管中，并以 13000 min 在微量離心機中離心 5 min 使聚丙烯酰胺凝膠成為碎片，移開 0.5 mlPCR 試管，然后在每個試管中加入 300ul 的 LoTE，渦漩振蕩，然后在 37℃ 下孵育 15~30 min。

18.將聚丙烯酰胺凝膠混懸液移入一個 SpinX 柱中在微離心機中以 13000r/min 旋轉 5 min。

19.將每份濾液移入新的 1.5 ml 的 Eppendorf 試管中，并用等體積的 PCI 抽提（實驗方案 A，第 2 步)。

20.加入下列物質使液體發生沉淀：

一 lOOullOmol/L 的乙酸銨

一 3ul 的糖原

一 900ul 乙醇

21.在干冰/乙醇上冰浴 15 min。

22.在 4℃ 下，以 13000r/min 在微離心機中離心 5 min。

23.以 70% 乙醇沖洗沖洗沉淀 2 次，然后晾干。

24.在總體積為 7ul 的 LoTE 中重新溶于此 4 份沉淀物。