雙標記簽的PCR擴增

溶液與緩沖液 LoTE cDNA標簽

實驗方案 A 和 B

一、連接混合物的 PCR 擴增

1.加入 LoTE 使連接混合物的體積增至 20ul。

2.按 1% 濃度稀釋連接混合物。

3.在 50ulPCR 反應中以 Iul 的 1% 稀釋后的連接混合物作為模板：

4.最后，在 PCR 的反應中加入 1ul 稀釋的連接混合物作為模板。

5.用下列條件來進行 PCR 擴增：

在進行 PCR 擴增后，在 12% 聚丙稀酰胺凝膠上電泳分析 IOul 的 PCR 混合物，用一個 IOul 的 ladder 作為標志，我們推薦用 Mini-PROTEANII 垂直電泳系統進行電泳 (BioRad)。

二、大量 PCR 的純化（n=IOO)

1.在稀釋的連接混合物大量地擴增之后（100XIOOul 的 PCR 反應)，在 100 ml 的燒杯中混合（混合體積為 10 ml 左右)。

2.50 ml 的 PB 緩沖液（QIAquickPCR 純化試劑盒）于稀釋的 PCR 混合物中，混勻。

3.向 16 個 QIAquick 柱中，每個加入 600ul。

4.在微量離心機中以 13000r/min 離心 45s。

5.移去過濾液并用同一柱重復 5 次，每次均加入稀釋的 PCR 混合物 600ul。

6.在移去最后 1 次過濾液后，離心 1 次以去除所有的液體。

7.用 0.75 ml 緩沖液 PE 沖洗（QIAquickPCR 純化試劑盒)。

8.以 13000r/min 在微量離心機中離心 45s。

9.棄去流過的液體，并再全速旋轉 Imin 以去除所有的液體。

10.將此柱置入一干凈的 1.5 ml 的 Eppendorf 試管中。

11.一個柱中加入 30ul 的洗脫緩沖液（QIAquickPCR 純化試劑盒)。

12.在室溫下放置 15 min。

13.以 13OOOr/min 在微量離心機中離心 Imin 以洗脫 DNA。

14.將 16 柱洗脫的 DNA 混合入一個試管中（總體積為 480ul)。