雙脫氧法DNA測序實驗——α標記核苷酸進行熱循環測序反應

DNA

DNA測序緩沖液dATPDNA聚合酶

熱心換反應裝置離心機

1.  對應于毎個待測模板，分別以A、G、C、T 標記好4個微量離心管。

2.  分別往標好A、G、C、T 的管子中，加A、G、C、T 測序混合液各3 μl。

3.  對于單鏈模板：在0.5 ml 微量離心管中混勻下列試劑

（1）0.04 pmol 單鏈DNA模板

（2）0.6 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×Vent_R（exo^-）測序緩沖液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）用吸管上下抽吸輕輕混勻溶液。

4.  對于雙鏈DNA模板： 在0.5 ml 微量離心管中混勻下列試劑

（1）0.1 pmol 雙鏈DNA模板

（2）1.2 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×Vent_R（exo^-）測序緩沖液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）通過用吸管上下抽吸，使溶液混勻。

5.  毎個模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml［α-³⁵S］dNATP、［α-³²P］dNATP或［α-³²P］dNATP，用吸管輕輕上下抽吸混合溶液。

6.  經步驟5操作后的管子，加入1 μl 2 000 U/ml 的Vent_R（exo^-）DNA聚合酶。

7.  立即往步驟2的含Vent_R（exo^-）測序混合物A的管子中加入3.2 μl 步驟5操作后所得的混合物。

8.  分別重復此過程于C、G、T管，每次均換吸頭，反應混合物，置于冰上。

9.  往每個反應混合物上滴入1滴無菌礦物油。

10.  在熱循環反應裝置中設定如下反應條件：20循環：20 s，90℃；20 s，55℃；20 s，72℃反應管放入熱循環儀中，啟動程序。

11.  在礦物油層下加入4 μl TCS終止/加樣染料。

12.  樣品在85℃溫育3 min。

13.  將吸管頭插入覆蓋礦物油層下面的反應物中，取2 μl 加樣于測序膠進行電泳，并讀出序列。