雙色同步成像在熒光共定位等成像實驗中的應用（二）

雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機作兩臺用

采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號成像到一臺相機的一個感光芯片上很好地解決了同步成像的時間問題，但對于絕大多數的相機，整個感光芯片只能設置一個曝光時間，當兩個顏色的信號強度相差較大時將很難同時將兩個顏色的成像信噪比保證在最佳狀態。

而濱松Flash 4.0 LT則可以分別調整同一芯片上下兩半的曝光時間。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的時候，我們可以非常靈活地調整兩個顏色信號的相對亮度，得到更加能夠突出所需信號和結構的圖片。在兩個顏色通道的信號差別非常大的時候，Flash 4.0 LT + W-View GEMINI這種靈活的曝光時間設置就可以針對不同的波長設置不同的曝光時間，同時保證兩個波長信號的信噪比。

W-View GEMINI應用實例1——表達Cameleon (YC3.60)的HeLa細胞在收到組胺刺激時的高速鈣離子成像

在細胞內鈣離子濃度高速變化的場合下，雙色同步成像可以保證數據的高速采集。以這個實驗為例，YC3.60的分子中包含CFP、YFP兩個部分，沒有鈣離子結合時，兩個部分距離較遠，用430nm的光激發時得到的是CFP所發射的480nm的青色信號；當結合了鈣離子之后，YC3.60中CFP和YFP兩個部分在分子中會挨到一塊兒，符合CFP-YPF發生FRET的條件，430nm激發光照射時，能量將由CFP轉移至YFP，發射出535nm的黃色熒光信號。所以通過實時檢測480nm和535nm的信號強度比值就可以監測細胞內鈣離子的濃度。

如果采用濾光輪，假設不同濾光片位置的切換時間為30ms（這已經是比較出色的產品了），CFP和YFP各自需要30ms曝光時間，一個數據點需要切換兩次濾光片位置（如從CFP切換到YFP然后還得切換回來預備下一個數據點的采像），所以總共需要120ms來采集一個數據點，結果就是當我們采用濾光輪的配置時每秒鐘我們只能得到8-9個數據點（鈣離子濃度數據）。

而采用W-View GEMINI時，30ms的曝光時間內就可以同時采集到CFP和YFP的熒光信號，而且沒有顏色切換的時間損失，最終保證了33幀/秒的高速成像，也就是說，每秒鐘我們可以得到33個鈣離子濃度數據點。

兩種方法在動力學上的表現高下立判。

W-View GEMINI應用實例2——采用Di-4-ANEPPS對hiPS-心肌細胞的膜電位變化進行成像

對于樣品有位置移動的情況下，雙色同步成像可以抵消樣品位置變化所造成的誤差。

比如這個例子中的誘導心肌細胞，我們需要通過Di-4-ANEPPS這個染料對其膜動作電位進行成像。Di-4-ANEPPS這種熒光染料通過藍光（~488nm）激發，其發射波長卻會根據膜電位而有所變化，通過計算細胞不同區域內525nm/630nm的比值就可以得到此區域內膜電位的變化。這種成像方法相相對膜片鉗等電生理方法而言，可以得到細胞任意位置的膜電位變化，空間分辨率更高。而W-View GEMINI雙色分光附件以及高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機的應用也保證了其極高的時間分辨率（每秒100個數據點），使得我們可以對細胞任意位置的動作電位進行時間空間都非常精確的測量。

W-View GEMINI應用實例3——線蟲鹽敏感（salt-sensing）神經元在NaCl濃度變化時響應的時空關系分析

在這個例子中，為了監測ASER和AIY兩個神經元在外界NaCl濃度變化時的表現，研究者分別在兩個神經元上表達標記了紅色和綠色的鈣離子敏感熒光蛋白R-GECO1與G-GECO1.2，然后讓環境中的NaCl濃度以10秒為周期在0mM和50mM之間切換。通過分析兩個神經元內鈣離子的濃度變化，可以看出兩個神經細胞兩者在NaCl不同濃度下的相反表現。