雙重和多重原位雜交(hybridizationinsitu)技術

為了在同一標本上或同一細胞內同時檢測是否存在兩種或兩種以上的靶核酸序列。可應用雙重或多重原位雜交技術．即以兩種或多種標記探針與靶核酸雜交。然后利用不同的檢測手段分別顯示各種靶核酸的存在和分布。該技術與免疫組織化學技術中的雙重或多重標記相似，除了探針本身的特異性外，對結果的干擾主要來自標記物及檢測試劑的互相影響。

（一）放射性核素和非放射性標記探針的雙重標記原位雜交

非放射性標記原位雜交技術的興起和發展，為雙重標記原位雜交提供了有效的技術途徑。在將放射性核素和非放射性物質標記的兩種探針結合進行的雙重標記原位雜交技術中，常用的放射性核素標記物為35S，常用的非放射性標記物為生物素和地高辛。該雙重原位雜交技術可分為一步法和二步法兩種。在一步法中，原位雜交反應用兩種探針的混合物一次完成，顯示雜交信號時，先用堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素與雜交體上的生物素結合，并用硝基四氮唑 (NBT)和5—溴—4—氯—3—吲哚—磷酸鹽(BCIP)作為底物顯示雜交體上的堿性磷酸酶(或用ABC法顯示雜交體上的生物素)或以堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體與雜交體上的地高辛結合，并用NBT和BCIP顯示堿性磷酸酶，標本脫水干燥后再進行放射自顯影處理以顯示另一靶核酸。一步法的優點是雜交反應一次完成，操作流程較短，同一細胞內的兩種信號容易分辨；缺點是放射自顯影的陽性信號要比單標時明顯減少，堿性磷酸酶或ABC的陽性反應產物有可能會引起核乳膠的化學顯影。在二步法中，先后使用不同的探針進行兩次雜交反應，一般先用35S標記探針進行原位雜交，放射自顯影顯示第一種雜交體后再用生物素或地高辛標記的探針進行第二次原位雜交，按生物素— 親和素—堿性磷酸酶法(或ABC法)或地高辛—抗地高辛抗體—堿性磷酸酶法顯示第二種雜交體。二步法的雜交信號在鏡下明顯可辨。用放射性核素標記探針進行第一次原位雜交的整個操作順序，包括放射自顯影的顯影定影過程，不會改變mRNA的結構，也不會影響第二次雜交反應時靶核酸對探針的可及性。二步法的整個操作流程要比一步法長，但它沒有一步法中存在的放射性標記信號的丟失，以及堿性磷酸酶(或ABC)陽性反應產物可能引起乳膠化學顯影的弊端。

（二）非放射性標記探針的雙重標記原位雜交

如果用不同的標記物標記不同的核酸探針，只要互相不影響各自的雜交反應，檢測系統也不相互干擾，雜交信號易于分辨，原則上均能用于雙重或多重標記原位雜交。應用非放射性標記探針的雙重標記原位雜交。可克服放射性核素標記探針的分辨率低、時間長以及放射性污染等缺點。

1．應用生物素和地高辛標記探針的雙重標記原位雜交應用生物素和地高辛分別標記的兩種探針進行雙重標記原位雜交時，雜交反應可用含兩種標記探針的雜交液一次進行。因為生物素標記探針可用辣根過氧化物酶標記的親和素檢測(以3—氨基—9—乙基—卡巴唑為底物，陽性反應產物為紅色)，而地高辛標記的探針用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體來檢測(反應產物為藍色)，兩個檢測系統互相無干擾，所以，標記的親和素和抗地高辛抗體也可混合在一起一次孵育。但兩種酶的呈色反應需要的pH條件相同，故呈色反應需分先后兩次進行。

2．雙重熒光標記原位雜交利用具有不同顏色的熒光素分別標記不同的核酸探針，可檢測同一組織或細胞內兩種不同的靶核酸。用不同的熒光素作標記物進行雙重標記原位雜交，有直接法和間接法兩種。直接法將具有不同顏色的兩種熒光素分別標記兩種不同的核酸探針，用其做原位雜交，雜交信號能在熒光顯微鏡下通過選擇不同的激發濾片而直接觀察。此法操作簡便，但敏感性不高。間接法用生物素和地高辛分別標記兩種不同的核酸探針，然后用不同熒光素標記的親和素(或抗生物素抗體)和抗地高辛抗體來檢測雜交體。間接法比直接法敏感性更高。

（三）兩種放射性核素標記探針的雙重標記原位雜交

用3H和35S分別標記兩種不同探針，用混合探針做原位雜交。在放射自顯影時，標本被覆兩層核乳膠，并在兩層核乳膠之間用一層透明的塑料膜將其分開。因3H的β射線能量低，故3H 的信號在第一層乳膠上；35S的β射線能量高。它不僅能使第一層核乳膠曝光，而且還能穿透塑料薄膜使第二層核乳膠曝光，結果35S 的信號可同時在兩層核乳膠中見到。兩層乳膠上的信號用彩色顯微放射自顯影術分別顯為深紅色和藍色，兩種雜交信號更容易在鏡下鑒別。

此法雖能在同一標本上檢出位于不同細胞中的兩種靶核酸，但不能分辨位于同一細胞中的兩種靶核酸。而且，該技術操作復雜、檢測過程需要兩次放射自顯影，所費時間較長，故推廣使用受到一定限制。