1．一步雙染色法先將兩種熒光標{己抗體按適當比例混合(A+B)，按直接法進行染色。
2．二步雙染色法先用TRITC標記的A抗體進行免疫熒光染色，再用FITC標記的B抗體染色，根據兩種抗體的動物種屬不同，可用直接法也可用間接法，結果A抗原呈現橘紅色熒光，而B抗原呈現黃綠色熒光。在應用中，常用的方法是免疫熒光組織化學中間接法和SABC-Cy3法相結合。例如，在實驗設計時，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗，相匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。
進行雙重染色時，由于兩種一抗種屬來源不同，可把一抗混合使用。孵育結束后洗滌未結合的一抗，滴加二抗時，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗滌后，滴加SABC-Cy3復合物，經熒光顯微鏡下觀察已出現特異性熒光，再進行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片觀察。其結果A抗原呈現綠色熒光，B抗原呈現紅色熒光。
此法應注意兩種一抗在混合稀釋時，抗體的終濃度應為每一種抗體的工作濃度。換言之，混合后的液體要同時滿足兩種一抗的工作濃度。若兩種一抗種屬來源相同，必須分兩次進行雙重染色，即先用第一種一抗和第一種熒光二抗對A抗原進行染色，洗滌后，用第二種一抗和第二種熒光二抗對B抗原進行染色，否則會出現交叉反應而使染色無特異性。