反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.
反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環狀 DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。
反向PCR原理
反向PCR程序
用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向
PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環
化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切酶失活。
聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用于測序時，與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。
反向PCR的局限
反向PCR在研究轉座因子、反轉錄病及其他 能與基因組DNA整合或易位的DNA序列中有許多重要應用。這些應用包括序列的易位、
轉座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因或免疫系統的基因組成。在所有
這些情況中，如已知序列插入未知序列或與未知序列并列，反向PCR可用于測定未知
邊側序列。反向PCR的主要優點是簡單快速，可以研究許多獨立克隆。其某些應用適 合于臨床診斷。
反向PCR的局限之一是由未知邊側序列性質引起的，需用幾種酶試驗以選擇產生 大小合適的片段的內切酶。另一局限是許多常用內切酶也在不適當位點裂解載體序 列。但一旦確定合適的內切酶，反向PCR方法是直接了當和可靠的。
大多數真核基因組含大量中度或高度重復序列，YAC或科斯粒中未知接點序列有時也 包括這些序列。通過反向PCR擴增得到的探針可與許多基因組序列雜交，但它們在用 于染色體的步查或跳查方面會受到限制，在這種情況下，需要進行亞克隆。