反向PCR（inversePCR）

反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。

DNA樣品

T4 DNA連接酶（T4 DNALigase） 引物 EcoR I  ddH2O  酚 氯仿 無水乙醇 乙酸鈉

電泳儀 離心管 離心機 超凈臺 水浴鍋

一、限制性內切酶消化
 

1.  選擇合適的限制性內切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應對基因組DNA定量。
 

2.  根據T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：
 

37℃ 過夜，電泳檢測酶切效果。

二、回收DNA
 

1.   將酶切產物轉到1.5 ml離心管中，用ddH₂O洗滌干凈，并稀釋到250 ul；
 

2.   加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1 min；
 

3.  最大速度（13 000 rpm）離心1 min；
 

4.   將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1 min；
 

5.   最大速度（13 000 rpm）離心2 min；
 

6.   將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預冷的無水乙醇，0.1倍體積的3 M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5 min；
 

7.   4℃最大速度（13 000 rpm）離心10~15 min；
 

8.   棄上清，盡量除去管壁上的液體；
 

9.   加入1 ml -20℃預冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。最大速度（13 000 rpm）離心5 min；
 

10.   除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發掉，20~40 ul ddH₂O溶解。-20℃保存。
 

三、連接

1.  體系如下：

2-14℃   過夜

2.  連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進分子內的連接，減少分子間的連接。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14℃連接48 h）。連接完成后，65℃ 水浴10 min滅活。按上述3.抽提回收，溶解于40 ul ddH₂O中。

3.  然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。

1. 需要從許多酶中選擇合適限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。

2. 基因組DNA必須酶切完全。

3. 為提高分子間連接的效率，連接反應中DNA的濃度要低，因為高濃度的DNA可能會提高非同源連接水平，從而產生非特異性擴增。

4. 成環的cDNA進行裂解和變性比較重要，因為環狀雙鏈DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反應，它只可以擴增出較短的DNA片段。

5. 堿變性法已成功地用于制備PCR和測序DNA，該方法也可以有效地使環化的雙鏈cDNA實現變性。