反向PCR

噬菌體 T4 連接酶 限制性內切核酸酶 熱穩定 DNA 聚合酶 寡核苷酸引物 模板 DNA

擴增緩沖液 ATP 氯仿 dNTP 貯存液 乙醇 酚 氯仿 乙酸鈉 TE Tris-Cl

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 屏蔽型槍頭 離心管 正向排液式移液器 PCR 儀

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

ATP ( 10 mmol/L )

氯仿

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

乙醇

酚：氯仿（1：1，V/V)

乙酸鈉（3 mol/L）

TE ( pH 8.0)

Tris-Cl (10 mmol/L，pH 7.6)

2. 酶與緩沖液

噬菌體 T4 連接酶（1 單位/μl）

限制性內切核酸酶

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

寡核苷酸引物1 ( 20 μmol/L) 和寡核苷酸引物2 ( 20 μmol/L）溶于水中

模板 DNA 溶于 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，內含少于 0.1 mmol/L EDTA

5. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）

正向排液式移液器

PCR 儀

二、方法

1. 設計和合成寡聚核苷酸引物 1 與引物 2 是根據已知的 DNA 序列。

2. 消化 2~5 μg DNA 模板（序列復雜度小于 10⁹ bp）應用適當的限制性內切核酸酶。抽提這種酶切消化的 DNA 樣品，應用酚: 氯仿和氯仿各抽提樣品一次；用 2.5 倍體積的乙醇沉淀 DNA 樣品，再加 0.1 倍體積的 3 mol/L 乙酸鈉；高速離心回收沉淀的 DNA 樣品；沉淀用 TE ( pH 8.0) 溶解，使 DNA 樣品的濃度為 100 μlg/ml。

3. 用一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板，依次加入以下連接反應試劑，內含濃度范圍在 0.1~1 μg/ml 的酶切消化的模板 DNA 樣品：

模板 DNA                                     10 ng~100 ng

10X 連接緩沖液                            10 μl

1 單位/μl 噬菌體 T4DNA 連接酶      4 μl

10 mmoI/L ATP                             10 μl

H₂O 補足至                                  100 μl

反應管在 16℃ 水浴上放置 12~16 h。

4. 用酚: 氯仿和氯仿備抽提連接反應液 DNA 樣品一次。用 2.5 倍體積的乙醇和 0.1 倍體積的 3 mol/L 乙酸鈉沉淀 DNA 樣品。用高速離心回收沉淀的 DNA 樣品，用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6) 或水溶解 DNA 樣品。濃度配制成 100 μg/ml。

5. 用一只 0.5 ml 薄壁離心管，依次加入如下試劑，混合：

10X 擴增緩沖液                                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

20 mmol/L 寡核苷酸引物1                       2.5 μl

20 mmol/L 寡核苷酸引物2                       2.5 μl

1~5 單位/μl 熱穩定 DNA 聚合酶              1.0 μl

H₂O                                                      28~33 μl

已環化 DNA 模板                                   5~10 μl

總體積                                                  50 μl

6. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層加一滴礦物油（約 50 μl）防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。另一種方法是，如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置擴增離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：



7. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。