反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大．對于非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠《氰基<C1(TMS)<C3<C4<苯基<C8≈C18(強)。
溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80 A°)的比表面積約為250 m2/g，而300A°孔徑載體的比表面積約為60 m2/g。當其他條件相同時，溶質在300A°孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80A°孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于強親水性樣品洗脫。
樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決于有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度。在反相色譜中，采用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低的保留值。固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基柱、苯基柱、C8柱、C18柱等的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8柱、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱。