反相色譜RPC

　　

反相色譜（ RPC）是高效液相色譜HPLC最受歡迎的一個應用，尤其對蛋白的表征非常有用。因為樣品的洗脫與其增水性有很大關系，一般不可能在洗脫時間（體積）的基礎上識別被分離的樣品。通常，每一洗脫片段都必須用其它技術進行進一步的分離和分析，才能得到蛋白質分子的分子行為表征。

在 HPLC系統的基礎上，加上一臺miniDAWN或DAWN檢測器，會大大簡化蛋白的表征，可以直接測絕對分子量并可觀察溶液中的蛋白特性。

圖 1是輕度氧化的基本纖維原細胞增長因子（bFGF）（由0.2當量的DTNB制成）的色譜圖。前兩個峰的光散射信號大約是UV信號的兩倍，而第三個峰兩者的信號強度相等。從圖上很清楚地看出，從左到右三個峰，其中兩個是兩種二聚體，一個是單體bFGF，它們的分子量分別是33K，34K，17K道爾頓。

圖 2是四個不同組分的分子量對洗脫體積圖，每一組分都有不同程度的氧化。很明顯，存在著二聚體、三聚體、四聚體，但出現的順序和洗脫體積的順序不一致。

采用的系統是 HPLC，包括HP 1050四元泵、脫氣機、自動進樣器，UV二極管陣列檢測器和一臺miniDAWN。一根Vydac C4蛋白柱。（150mm×4.6mm,300埃），流速0.7ml/min.

miniDAWN可對每個洗脫峰進行絕對表征，另外，還可測得每一洗脫片段的均方根旋轉半徑。例如：對bFGF五聚體，其旋轉半徑大約為13納米，表明分子量85K道爾頓的多聚體是棒狀結構的構型。

只要在反相色譜 RPC上加一臺miniDAWN就可對每一洗脫片段測量絕對分子量、多聚體的形狀、分子尺寸 、分子構型。