反相鍵合相液相色譜儀又稱非極性鍵合相液相色譜儀，在液相色譜儀中占有重要地位。
一、分離機理：
有疏溶劑理論和雙保留機理。
1、疏溶劑理論：
疏溶劑理論認為非極性烷基鍵合相是在硅膠表面蒙覆了一層以Si－C鍵化學鍵合的十八烷基（或其它烴基）的分子毛。溶質分子（分析物）有非極性部分和極性官能團部分組成。當溶質分子的非極性部分與極性溶劑接觸時，相互間產生斥力，此現象稱為疏溶劑。當溶質分子的極性部分與極性溶劑接觸時，相互間具有親和力。當鍵合相表面的烷基（分子毛）與極性溶劑接觸時，相互間產生斥力。而當溶質分子的非極性部分與鍵合相表面的烷基（分子毛）接觸時，則相互間產生締合作用。這種締合作用是可逆的，締合作用的強弱決定溶質分子色譜保留的強弱。
影響溶質保留值的因素：
（1）溶質分子結構：
在一定的洗脫液和溫度下，溶質分子的logk與溶質分子中的非極性部分的總表面成正比。
溶質分子中非極性部分相同，增加極性基團，因為增加了溶質分子與洗脫液的極性分子間的作用力而使k減小。
（2）烷基鍵合相特性：
烷基數量越多，溶質保留越強。
烷基碳鏈越長，溶質保留越強。
隨著烷基碳鏈的增長，增加了鍵合相的非極性作用的表面積，其影響溶質的保留值和色譜柱的選擇性（即隨烷基碳鏈的增長，其對溶質分離的選擇性增大）。
（3）流動相性質：
流動相的表面張力越大，解締合時釋放的能量越多，k越大。
流動相極性越大，表面張力越小，k越小。
（4）溫度：
溫度升高，保留值降低，柱效提高。
2、雙保留機理：
雙保留機理包括疏溶劑效應和親硅醇基效應。
親硅醇基效應認為烷基鍵合相表面往往有殘余硅醇基，這是一種微量酸性基團，可與溶質陽離子或氫鍵基團相互作用，主要影響含氮類藥物的分離，造成色譜峰拖尾，柱效下降。
可加入掃尾劑降低硅膠的吸附作用，常用的掃尾劑為有機堿類，如三乙胺等。
二、鍵合固定相：
鍵合固定相是在硅膠表面鍵合了非極性有機基團（烴基硅烷）的固定相。
常見的烴基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基。其中以十八烷基鍵合相（ODS或C18）應用最廣泛。
三、流動相：
溶劑極性越低，洗脫能力越強。
1、常用流動相：
（1）甲醇－水。
（2）乙腈－水。
（3）四氫呋喃－水。
溶劑強度為水＜甲醇＜乙腈＜四氫呋喃。
系統（2）較系統（1）好，原因如下：
系統（2）的粘度較系統（1）小，柱效好。粘度降低，柱壓降低，傳質阻力降低（溶質擴散阻力降低）， 柱效升高。
乙腈的紫外末端吸收較甲醇小，在低波長處測定時，基線波動較甲醇小，測定誤差小。
2、流動相的選擇：
（1）二元溶劑系統：
一般以洗脫能力最弱的水作為底劑，再加入一定量的可與水互溶的有機極性調節劑。常用的極性調節劑為甲醇和乙腈。
（2）多元溶劑系統：
在二元溶劑系統中加入少量的四氫呋喃，常能改善某些難分離的物質對的分離度。
用水、甲醇、乙腈和四氫呋喃組成三元或四元溶劑系統，并進行優化，選出zui佳溶劑系統。
3、溶質保留值隨溶劑極性變化的一般規律：
有機溶劑比例減小：
（1）溶劑的極性增加，洗脫能力降低，溶質的保留時間增加。
（2）不同溶質組分間的分離度增加。
（3）溶質的柱效降低。