反相鍵合相色譜儀的分子毛分離機理認為反相鍵合相色譜儀的非極性烷基鍵合相是一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的分子毛,這種分子毛有較強疏水特性。當用極性溶劑為流動相分離含有極性官能團的有機化合物時,分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產生締合作用,使它保留在固定相中;分子中的極性部分受到極性流動相的作用,使它離開固定相,并減小其保留作用。兩種作用力之差,決定了分子在反相鍵合相色譜儀中的保留行為。