反相高效液相層析實驗

蛋白質

TFA 乙腈 鹽酸胍

層析柱 HPLC進樣器

1.  用經脫氣的HPLC級水洗去反相柱的有機溶劑，梯度從100%有機溶劑到100%水，流速1 ml/min，持續15 min 以上。

2.  以100%的TFA/乙腈緩沖液平衡柱子至柱壓和光吸收值達到恒定。用10~15 min 的線性梯度使之逐漸轉到0.1%TFA水溶液，并以0.1%TFA平衡15 min。

3.  進行空白樣品的層析檢查柱子：流速1 ml/min，0~100%TFA/乙腈緩沖液線性梯度，時間45 min 以上，保持在100%TFA/乙腈緩沖液5 min，然后以15 min 的線性梯度回復到0.1%TFA，保持15 min。

4.  將RP多肽恃準或多肽消化的混合物于5000 g 離心5 min。用HPLC只進樣器吸取上清，并加之于注射樣品環中。
 

5.  按步驟3的梯度進行層析。收集層析峰于不同的聚丙烯管中。如果柱子的使用間隔時間超過兩天時間的話，需要清洗柱子并貯存于有機溶劑中。

6.  用TFA/胍緩沖液溶解收集到多肽，用旋渦混合器使之溶解。

7.  在5 000 g 離心5 min， 并完成第二次如用于氨基酸序列分析，應直接將樣品加到供測序用的玻璃纖維濾膜如用于氨基酸成分分析，在合適的容器中干燥小份樣品并進行后續的水解。

檢測器的設定如下：對50 ~200 pmol 的多肽，滿量程吸收單位為0.1，500 pmol 則為0.3AUFS，1 nmol 時為0.5 AUFS，2 nmol 為1 AUFS；對蛋白質而言，相應的設定應高2~3倍。