反相高效液相色譜2

發布時間：2019-03-28 21:40 原文鏈接：反相高效液相色譜2

方案2 填充 RP-HPLC 毛細管微柱

試劑、試劑盒	甲醇 n-丙醇反相硅膠 TFA 乙腈溶劑體系
儀器、耗材	水浴超聲波儀色譜加樣器層析柱玻璃料末端接口環氧樹脂流動池正向光學掃描檢測器加熱槍加樣器液相色譜柱填充泵微柱聚丙烯離心管聚硅酸鹽管藍寶石切刀信號數據收集裝置硅膠隔膜 Teflon接頭 UV檢測器
實驗步驟	一、毛細管液相色譜系統的構造下面所用的溶劑傳送系統（見圖 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色譜儀）被用作「輔助（slave)」泵來形成微梯度。二、流體的形成 1.為使通過毛細管柱的流速精確到0.05~20ul/min，并能形成可重復的梯度，可以安裝一個預加樣分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引導 95% 以上的溶液通過一個長約為 1OOcm(內徑 0.1OmmX 外徑 0.26 mm) 的溶合桂膠管流人廢液池。 2.直接將毛細管柱連接到帶有0.2~1.Oul 內置樣品轉子的 Rheodyne7520 型加樣器或裝有0.5~50ul 加樣環的 8125 型加樣器上。 3.將層析柱的流速精確設置到 0.4~4ul/min 可通過調節熔合硅膠管到廢液池的長度或改變栗的流速（100~500ul/min) 來完成。對于這種分流的方法，定期（如每天）監控層析柱的實際流速是很重要的。可以通過在出口處安裝一個 10ul 的色譜注射器，對層析柱中液體的彎月面的推進進行精確計時。有關該系統構造中所提到的各種部件及其供貨商的詳細情況在「2.1 材料」中列出。三、UV 檢測器 1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光學掃描檢測器，以 214nm 吸收值來檢測毛細管 HPLC 系統的洗脫情況，該檢測器裝有一 U 形縱向毛細管流動池（路徑長度 6 mm，容積約 26.5 ml)。 2.Spectra Focus 軟件傳輸到個人電腦上，或者同時用多波長模式（195~340 mm，5 mm 間隔）來記錄。 3.對于毛細管液相色譜/質譜儀（LC/MS) 聯用，用一根 50 cm 長的熔合硅管 (內徑 0.05 mm X 外徑 0.19 mm) 將 UV 檢測器直接與電噴霧入口連接起來。該管替代了標準不銹鋼電噴霧針，可一直延伸到噴射針的頂端。 4.對于納流（nanoflow) 毛細管 HPLC, 納流端直接與出口相連。四、毛細管柱的構造大量的文獻已介紹了構成微柱的多種物質，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不銹鋼（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亞胺外殼的溶合桂管（Yang,1982)。我們一般采用后者來制備微柱。與上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亞胺外殼的熔合硅管具有許多顯著的優點（見表 5.8)，如具有靈活性、易于處理和可通透性，且有商品化的各種不同內徑和外徑的型號，其價格相對低廉。下面以 250 mmX0.20 mm 內徑的層析柱為例，分步介紹0.1~0.32 mm 內徑熔合硅微柱的組裝過程。 1.切兩段不同長度的聚酰亞胺熔合硅管，其中一段長為 250 mm(內徑 0.200 mm，外徑0.340 mm) 作為柱體，另一段長為 20.0 mm(內徑 0.050 mm X 外徑 0.190 mm) 作為層析柱的出口管。注意：在填充層析柱的過程中，要戴防護眼鏡，并遵循推薦使用的安全程序。（1）用懸漿填充法將色譜支持物填充到薄壁毛細管的過程中，毛細管因受到高壓（約 40MPa) 而易于折斷。例如，在本實驗中，內徑0.32 mmX 外徑 0.540 mm 和內徑 0.200 mmX 外徑 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高達 45MPa 的局壓，而內徑 0.320 mmX 外徑 0?450 mm 的管子在同樣的壓力下卻容易折斷，其填充壓不得超過 5MPa。最后，還必須注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以較高的壓力填充，從而能夠使層析柱獲得良好的工作效率。（2）為避免毛細管末端參差不齊，可以用藍寶石刀來代替較為普通的玻璃刀。末端參差不齊的管子將會導致玻璃料定位不精確。（3）用 Teflon 管來連接熔合硅管（見圖 5.10)。由于來自不同廠家的熔合硅管的外徑有細微的差別，通常加固這些接頭以達到緊密連接。一般可以方便地采用兩個鉗子來夾緊內徑稍大的 Teflon 管。 2.用一較短（50 mm) 的溶合桂管（內徑 0.32 mm 或 0.20 mmX 外徑 0.45 mm 或 0.34 mm) 作為圓盤切割器，從一大張 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通過將 PVDF 膜置于硅膠隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管將 PVDF 封管膜片插入到微柱中，約 1Omm 深。另外，有很多有孔膜物質可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纖維濾紙（Davis 和 Lee，1992)、親水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本實驗中，采用了 0.45um 的多孔性親水 PVDF 膜。 3.永久固定微柱體和微柱出口管：在兩管接頭處滴一小滴預處理過的環氧樹脂。環氧樹脂已部分聚合或用加熱槍處理使其塑化，以增加其黏度，因此不會滲人毛細管造成阻塞。五、層析柱的填充當將 PVDF 封管膜片固定好，熔合硅毛細管柱制備完成，便可以開始用懸漿填充法的程序來填充微柱。 1.用帶有標準的內置液相色譜柱（0.5 mm 內徑的流通孔以及 l/4in(0.635 cm) 柱末端接口）的中空 50 mmX2 mm 內徑的玻璃襯里不鎊鋼管制備一個懸漿槽。 2.用 vespel 材料/石墨和手擰螺母將熔合硅微柱與標準的 1/4111 液相色譜末端接口連接起來。 3.在 I.5 ml 聚丙婦管中將反相桂膠漿在 n—丙醇（Aomg/zoojul) 中超聲處理 15 min。 4.在填充層析柱之前，先按標準色譜柱填充法，用填充溶劑（n_丙醇）在高壓下（40MPa) 填充毛細管柱。這一步使用填充溶劑預填充微柱，可檢測系統的密封性。 5.從層析柱填充機和微柱上將懸槳槽卸下，倒空，再復位，裝入備好的 150ul 的反相硅膠漿混合物。 6.在恒壓 40MPa 下，裝柱 20 min; 在相同壓力下再用 50% 甲醇溶液固定 20 min，然后就可以給層析柱減壓了。 7.小心地拆下層析柱，將其頂端和底端都插入硅膠隔膜中，以使之密封。展開

試劑、試劑盒

甲醇 n-丙醇反相硅膠 TFA 乙腈溶劑體系

儀器、耗材

水浴超聲波儀色譜加樣器層析柱玻璃料末端接口環氧樹脂流動池正向光學掃描檢測器加熱槍加樣器液相色譜柱填充泵微柱聚丙烯離心管聚硅酸鹽管藍寶石切刀信號數據收集裝置硅膠隔膜 Teflon接頭 UV檢測器

實驗步驟

一、毛細管液相色譜系統的構造

下面所用的溶劑傳送系統（見圖 5.10，AHewlett-Packard HP1090M 液相色譜儀）被用作「輔助（slave)」泵來形成微梯度。

二、流體的形成

1.為使通過毛細管柱的流速精確到0.05~20ul/min，并能形成可重復的梯度，可以安裝一個預加樣分流器（l/16in[1.59 mm] 的 T 形管），引導 95% 以上的溶液通過一個長約為 1OOcm(內徑 0.1OmmX 外徑 0.26 mm) 的溶合桂膠管流人廢液池。

2.直接將毛細管柱連接到帶有0.2~1.Oul 內置樣品轉子的 Rheodyne7520 型加樣器或裝有0.5~50ul 加樣環的 8125 型加樣器上。

3.將層析柱的流速精確設置到 0.4~4ul/min 可通過調節熔合硅膠管到廢液池的長度或改變栗的流速（100~500ul/min) 來完成。

對于這種分流的方法，定期（如每天）監控層析柱的實際流速是很重要的。可以通過在出口處安裝一個 10ul 的色譜注射器，對層析柱中液體的彎月面的推進進行精確計時。有關該系統構造中所提到的各種部件及其供貨商的詳細情況在「2.1 材料」中列出。

三、UV 檢測器

1.采用 ThemoGalactic/SpectraPhysics 正向光學掃描檢測器，以 214nm 吸收值來檢測毛細管 HPLC 系統的洗脫情況，該檢測器裝有一 U 形縱向毛細管流動池（路徑長度 6 mm，容積約 26.5 ml)。

2.Spectra Focus 軟件傳輸到個人電腦上，或者同時用多波長模式（195~340 mm，5 mm 間隔）來記錄。

3.對于毛細管液相色譜/質譜儀（LC/MS) 聯用，用一根 50 cm 長的熔合硅管 (內徑 0.05 mm X 外徑 0.19 mm) 將 UV 檢測器直接與電噴霧入口連接起來。

該管替代了標準不銹鋼電噴霧針，可一直延伸到噴射針的頂端。

4.對于納流（nanoflow) 毛細管 HPLC, 納流端直接與出口相連。

四、毛細管柱的構造

大量的文獻已介紹了構成微柱的多種物質，如 Teflon 管（Ishii，etal，1977)、玻璃不銹鋼（Chervet，et al，1989) 以及有聚酰亞胺外殼的溶合桂管（Yang,1982)。我們一般采用后者來制備微柱。與上面所提到的其他材料相比，具有聚酰亞胺外殼的熔合硅管具有許多顯著的優點（見表 5.8)，如具有靈活性、易于處理和可通透性，且有商品化的各種不同內徑和外徑的型號，其價格相對低廉。

下面以 250 mmX0.20 mm 內徑的層析柱為例，分步介紹0.1~0.32 mm 內徑熔合硅微柱的組裝過程。

1.切兩段不同長度的聚酰亞胺熔合硅管，其中一段長為 250 mm(內徑 0.200 mm，外徑0.340 mm) 作為柱體，另一段長為 20.0 mm(內徑 0.050 mm X 外徑 0.190 mm) 作為層析柱的出口管。

注意：在填充層析柱的過程中，要戴防護眼鏡，并遵循推薦使用的安全程序。

（1）用懸漿填充法將色譜支持物填充到薄壁毛細管的過程中，毛細管因受到高壓（約 40MPa) 而易于折斷。例如，在本實驗中，內徑0.32 mmX 外徑 0.540 mm 和內徑 0.200 mmX 外徑 0.340 mm 的熔合硅管可耐受高達 45MPa 的局壓，而內徑 0.320 mmX 外徑 0?450 mm 的管子在同樣的壓力下卻容易折斷，其填充壓不得超過 5MPa。最后，還必須注意使用厚壁的熔、合硅管，因其可以以較高的壓力填充，從而能夠使層析柱獲得良好的工作效率。

（2）為避免毛細管末端參差不齊，可以用藍寶石刀來代替較為普通的玻璃刀。末端參差不齊的管子將會導致玻璃料定位不精確。

（3）用 Teflon 管來連接熔合硅管（見圖 5.10)。由于來自不同廠家的熔合硅管的外徑有細微的差別，通常加固這些接頭以達到緊密連接。一般可以方便地采用兩個鉗子來夾緊內徑稍大的 Teflon 管。

2.用一較短（50 mm) 的溶合桂管（內徑 0.32 mm 或 0.20 mmX 外徑 0.45 mm 或 0.34 mm) 作為圓盤切割器，從一大張 PVDF 膜上切下 PVDF 封管膜片，即通過將 PVDF 膜置于硅膠隔膜上，然后在 PVDF 膜上打孔而制成 PVDF 封管膜片。一般用柱的出口管將 PVDF 封管膜片插入到微柱中，約 1Omm 深。

另外，有很多有孔膜物質可用作微柱的封管膜片，包括 Zitex 膜（Davis 和 Lee，1 卯 2)、玻璃纖維濾紙（Davis 和 Lee，1992)、親水性的聚偏二氟乙稀（PVDF) 膜（Moritz 和 Simpson,1992a，1992b)。在本實驗中，采用了 0.45um 的多孔性親水 PVDF 膜。

3.永久固定微柱體和微柱出口管：在兩管接頭處滴一小滴預處理過的環氧樹脂。

環氧樹脂已部分聚合或用加熱槍處理使其塑化，以增加其黏度，因此不會滲人毛細管造成阻塞。