反相高效液相色譜4

用于分析的肽或蛋白

丙酮乙腈（HPLC級）2 -丙醇乙醇硝酸鈉硫酸鈉硫脲三氟乙酸

分析型 HPLC 裝置離心機錐形瓶玻璃容器Hamilton 玻璃注射器氮氣冷凍干燥機流動相過濾裝置氦氣制備型 HPLC 裝置

一、流動相的配制

1.分別配制 1L 的洗脫液 A(弱流動相）和洗脫液 B(強流動相）。例如：

洗脫液 A 為 0.1%TFA 水溶液

洗脫液 B 為含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液要點：用于蛋白質測序的 TFA，因其含有抗氧化劑而不適用于 RPHPLC 樣品的洗脫。

有機溶劑和水必須分別用兩個量筒來測量，然后再混勻，因為混合時體積將會減小，最多可減少 3 〇 ml/L 總體積（由溶劑的特性決定）。如果沒有按正確方法配液，將會導致流動相成分比例的偏差。

實驗提示：在用水和有機溶劑洗脫時，為補償梯度洗脫中基線的變化 (因為在短波長下，大多數有機溶劑吸收的光比水多），要降低洗脫液 B 中離子對試劑的量（TFA，H3P04)。與洗脫液 A 相比要降低 10%~15%，從而產生平坦的基線（Dolan，1991)。

2.在容量瓶中，用 Teflon 包被的磁力轉子攪拌將溶液混勻。

警告：在任何情況下都不能用封口膜封閉裝有 RP-HPLC 洗脫液的長頸瓶或量筒。因為有機溶劑與洗脫液中酸性離子對試劑會溶解封口膜，使色譜出現非特異的峰。

3.用 0.2ul PTFE 過濾器先過濾洗脫液 A，然后過濾洗脫液 B。過濾洗脫液將會增加層析柱的使用壽命，有助于排出氣泡。

4.用塞子塞緊裝有洗脫液的瓶子，避免有機溶劑的揮發。

二、肽樣品的制備

1.先用終體積的一半的洗脫液 A 溶解樣品以達到所需濃度。如果樣品不容易溶解，加入少量（<25% 總體積）溶液B。

少量強流動相將造成樣品的預洗脫，洗脫程度由樣品環的大小、柱內徑、流動相梯度的起始成分決定。

2.檢驗樣品純度，如果含有不溶的乳光物質或固體顆粒，則要用0.2)umPTFE過濾器過濾樣品，或者離心后取上清液。

要點：如果樣品未完全溶解就不能加樣，否則會堵塞加樣器和層析柱。

3.樣品在不用時存放于4°C或-2°C，要依保存時間和使用情況而定。肽和蛋白質在室溫下會發生降解。

要避免樣品的反復凍融。將樣品分裝成小包裝，一20°C 保存，每次取出一次所用量。

三、RP-HPLC純化固相合成的多肽

1.檢測HPLC系統設備

以下的檢測能評價柱床完整性[低完整性與峰的分裂、峰的前伸(fronting) 或拖尾有關]和柱性能（根據塔板數），也能檢測柱的壽命(如果以相同的間隔時間重復檢測），并評估柱填充物批與批之間的差異。

（1）用空白對照進樣（進洗脫液A)并用與多肽或蛋白質相同的洗脫梯度（100%A—100%B) 進行洗脫，如果出現「鬼峰」（即假峰）就重復此操作。該步驟旨在清洗前次分離多肽和蛋白時可能遺留下的雜質。

（2）用硫脲或硝酸鈉來測量柱的死體積（或用其他不會導致交叉影響的溶劑）。

（3）在合適的檢測溫度下采用梯度法來檢測柱性能。例如采用下面的RP-HPLC測試混合物：

1.5 g/L二甲基鄰苯二甲酸

1.5 g/L二乙基鄰苯二甲酸

0.lg/L聯苯

0.3 g/L鄰三聯苯

3.2 g/L鄰苯二甲酸二辛酯（用甲醇溶解）

（4）通過梯度法和標準肽樣品檢測柱性能，如采用Mant和Hodgs(1991b)所描述的方法。

2.用RP-HPLC 分析多肽粗制樣

（1）在正式分析樣品之前，要先在同樣條件下至少做一組的空白對照。

如果出現峰，則重復該步驟。

（2）以分析型 RP-HPLC的程序分離粗制樣（約loo^g)。按以下信息框中列舉的實驗條件，根據純度、色譜峰圖、洗脫條件來評估樣品。

（3）鑒定所要純化的成分。

3.準備RP-HPLC

（1）按列出的實驗條件，用制備型RP-HPLC程序來分離粗制肽混合物（約25?IOOmg)。

為避免檢測器發生過載，一般用230?280nm的波長，但是在溶解粗制肽時，所加入的少量化學雜質（在SPPS步驟中使用）則會在該波長范圍內有非常強的吸收。應先進行一次預分離并在214nm處檢測，以確定主要肽產物的確切保留時間—雖然會有幾微克的樣品損失，但也是值得的。

（2）收集HPLC組分（3~7.5 ml)。

4.進行分析性RP-HPLC

（1）用分析性RP-HPLC對所收集到的組分（30~50ul）進行分析。

分別對空白對照、粗制樣溶液、目標組分及其前兩個組分和后兩個組分進行分析。

（2）通過比較純化后成分的保留時間和粗制樣中靶成分在色譜的保留時間，來確定收集到的含有在有效純度范圍內（即>95%) 目的蛋白的組分。

（3）將得到的多肽定量分裝在微量離心管中，一20°C保存，用于進一步研究。

5.進一步分析

（1）將純度在 95% 以上的樣品凍干。該純度是通過分析型RP-HPLC分離、尚效毛細管電泳（HP-CZE)(Sitaram，etal，1999;Hearn，etal，2002) 或毛細管電層析（HP-CEC)(Walhagen，etal，2000a，2000b，2001) 或其他適當的高分辨率分析技術評估出來的。

（2）對最純的組分進行離線（off-line)或在線（on-line) 電噴霧離子化質譜（ESI-MS) 分析，以確定合成的肽或蛋白是否正確，或者正確鑒別所要純化的成分。

如果得到的樣品質量與預期的不同，則有必要用 ESI-MS 再檢測一下其他組分。