反轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）診斷禽流感

近年來發展的RTPCR分子診斷技術具有高度的敏感性和特異性，可大大縮短對AIV病毒的檢出時間，克服了傳統的禽流感診斷技術的缺點，為禽流感早期快速診斷提供子敏感、快速、實用的方法。1986年，Perdue用聚合酶鏈反應（PCR）診斷禽流感，從接種雞胚到出結果僅用時36h。

趙建梅等在傳統一步法RT-PCR擴增各種病毒RNA的基礎上，進行了兩種病毒和三種病毒的一步法多重RT-PCR的試驗，認為此檢驗方法在實際工作中也有較大的使用價值。一步法多元-PCP,是指在一個PCR反應體系中同時設立2對或2對以上引物，用于擴增不同的目的片段。目前這種方法可以同時檢測流感病毒的型和亞型。S．K．Poddar將67份樣品分成兩部分，一部分用一步法多元PCR檢測，另一部分用已經建立好的單抗ELISA方法檢測，結果兩種方法之間有很好的吻合率。

E．Starick認為，用RT-PCR方法可以鑒別高低致病力AIV。而C．Steininger認為RT-PCR技術的靈敏度要高于病毒分離和ELISA，可以避免一些錯誤的陰性結果。B．Herrmann報道用巢式RT-PCR同時檢測A、B流感，從215份流感疑似病料中，巢式RTPCR檢出8份，病毒分離檢出66份，免疫熒光檢出68份陽性結果。E．Starick報道，設計了一個H7亞型特異性的巢式RT-PCR，擴增片段包括了血凝素裂解位點，可以依據裂解位點變化確定強弱毒株，他認為該方法與病毒的分離鑒定具有同樣的靈敏性，檢出率更高。

Y，Pang和M．LKhan等設計了分別針對雞傳染性支氣管炎病毒（1BV）、傳染性喉氣管炎病毒（1LTV）、新城疫病毒（NDV）、雞毒支原體（MG）、雞滑液囊支原體（MS）和AIV 6對引物進行的多重PCR反應。在用瓊脂糖凝膠進行檢測35輪PCR產物時發現檢出的敏感度DNA或RNA的量對IBV、AIV、MG和ILTV為long左右，對NDV和MS為100ng左右。該方法也適用于各種病原的混合感染時的病料。

國內謝芝勛等參考禽流感病毒M基因和HA基因序列設計了3對引物，其中1對為針對不同HA亞型AIV的通用引物，另外2對為分別針對H5和H7亞型的特異性引物，通過對多重RT-PCR擴增條件的優化‘，成功建立了快速檢測鑒別AIV H5、H7亞型的多重RT-PCR方法。該多重RT-PCR特異性好，對AIV不同亞型RNA的zui低檢測量為10pg，對AIVH5和H7亞型RNA的zui低檢出量為100pg。不需要對病原體進行分離增殖，就可對臨床疑似AIV感染的樣品或環境樣品進行直接檢測鑒別，避免了進行AIV分離增殖過程中散毒和傳播等風險。該多重RT-PCR快速檢測鑒別AIVH5、H7亞型技術的建立，對AIV高致病性H5、H7亞型感染的診斷及制定有效的防治措施具有實用價值和指導意義。