腺相關病毒(AAV)載體是治療多種人類疾病基因傳遞的主要平臺。最近在開發臨床所需的AAV衣殼、優化基因組設計和利用革命性生物技術方面的進展對基因治療領域的發展作出了重大貢獻。在AAV介導的基因替換、基因沉默和基因編輯方面的臨床和臨床上的成功幫助AAV作為理想的治療載體獲得了廣泛的應用。
腺相關病毒AAV基礎
AAV屬于細小病毒科的依賴病毒屬，它的生命周期依賴于輔助病毒(如AdV)的存在。AAV存在于多種脊椎動物中，包括人類和非人類靈長類動物.目前的共識是，AAV不會引起任何人類疾病，它由直徑為26nm的二十面體蛋白衣殼和一個單鏈DNA基因組組成，單鏈DNA基因組約為4.7kb，既可以是正鏈，也可以是負(反義)鏈。
衣殼由VP1、VP2和VP3三種亞單位組成，共60拷貝，比例為1：1：10(VP1：vp2：vp3)。基因組兩側有兩個T形倒置末端重復序列(ITRs)，主要作為病毒復制的起源和包裝信號。REP基因編碼四種病毒復制所需的蛋白質；它們是根據它們的分子質量命名的：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。
Cap基因通過不同起始密碼子的選擇性剪接和翻譯，編碼三個衣殼亞基。此外，編碼組裝激活蛋白(AAP)的第三個基因在不同的讀框中編碼在Cap編碼序列中，并已被證明能促進病毒子組裝。AAV基因組可以整合到人類細胞中的一個稱為AAVS1的基因組位點中以潛伏。這一現象在一定程度上是由于aavs1中發現的序列相似性以及ITR和REP活性。由于rAAV沒有REP基因，rAAV基因組整合大大減少。基因治療使用AAV多為重組AAV（rAAV)。
腺相關病毒AAV外殼改造
自20多年前rAAV被證明具有臨床應用前景以來，為獲得新的特性而設計的新型AAV衣殼一直是科學家不斷追求的目標。發展新的衣殼的戰略隨著技術的進步而發展。例如，低溫電子顯微鏡(cryo-EM)提供了關于衣殼殘基的結構和功能對穩定性的影響，以及抗體如何識別和附著在衣殼蛋白上的深入研究。這加速了新衣殼的鑒定和驗證。衣殼開發方法可分為三大類：自然發現、合理設計和定向進化。近年來，隨著計算能力和生物信息預測方法的改進，AAV衣殼設計出現了一個新的分支：硅發現。下面將討論這些方法的優缺點，以及一些證明這些方法的基礎的開創性研究。
自然發現的衣殼
正如上文所討論的，AAV最初被發現為細胞培養污染物，這就是最廣泛使用的血清型AAV 2。值得注意的是，最具臨床應用前景的載體血清型是從自然來源分離出來的。這一概念最好的縮影是AAV9，它是從人肝組織中分離出來的。AAV9是一種clade F型血清型，具有繞過血腦屏障(BBB)的能力，使其成為中樞神經系統(CNS)通過全身給藥傳遞的主要衣殼。肝臟和脾臟是人類和非霍奇金淋巴瘤(NHPs)自然AAV感染的主要部位，盡管前病毒序列可以從63-67個組織中分離出來。例如，最近引起關注的其他人類來源的cladeF衣殼是從CD34+人外周血造血干細胞中分離出來的，這表明它們具有進行無核酸酶基因編輯能力。
流行病學分析表明，40%-80%的人血清抗AAV抗體呈陽性反應，這表明人類源性衣殼可能并不是理想的基因治療載體，因為已經存在的AAV衣殼免疫可能會降低傳導效率。血清流行病學和分子學研究表明，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9是人類特有的。因此，從非人類來源分離衣殼可以克服免疫原性的問題。從非霍奇金桿菌中分離出的衣殼已顯示出很大的希望，NHP衍生的AAVrh.8、AAVrh.10和AAVrh.43(CladeE衣殼；AAV8也是成員)已被證明能傳遞一系列組織。然而，抗AAV8中和抗體(Nabs)在人類人群中的流行率從10%到40%不等，有地域差異。其他的E類衣殼因此可能表現出反應性。
許多研究現在集中在從其他脊椎動物種類分離出來的AAV衣殼的前景上，雖然這些衣殼在理論上誘發病人預先存在的免疫反應的可能性最低，但它們在人類中也可能表現出較低的傳導。值得注意的是，有報道稱豬源性的rAAV可以傳遞小鼠器官，其效率與金標AAV相媲美.最有希望的是，豬AAV不能被人免疫球蛋白G(IgG)中和，并且具有傳遞成年小鼠大腦的能力，這表明這些載體可以繞過BBB。
隨著高通量測序方法的進步，天然囊泡多樣性的發現變得簡化。長讀測序技術，例如單分子、實時(SMRT)測序允許在不需要序列重構的情況下對全長的臨時基因組進行測序。由于在來自個體患者的組織活檢樣品中觀察到多個AAV血清型，因此該技術提供了觀察由于幾個AAV基因工程之間的自然重組的結果的變體的能力。
合理設計的衣殼
第一批改進載體衣殼的方法是通過合理的設計進行工程設計。這種策略首先是簡單地嫁接與細胞類型特異性受體結合的肽序列。整合素結合肽序列被引入衣殼表面，導致AAV2重新靶向抗感染細胞。其他方法是將肽序列融合到VP2的氨基酸末端，例如單鏈可變片段(ScFVS)90和設計的ankyrin重復蛋白(DARPins)，使細胞表面標記物具有類似抗體的識別能力。另外，人們普遍認為，3倍突起在形成衣殼的定向和免疫原性方面起著重要作用，從而使3倍突起的暴露位置成為肽插入增強受體結合的理想位置。這種方法不僅可以延緩衣殼，而且還具有阻止免疫識別的能力。值得注意的是，在臨床試驗中使用的第一個工程載體衣殼，AAV 2.5是合理設計的衣殼。該衣殼通過將AAV1中的5個氨基酸轉移到AAV2衣殼支架上，表現出較好的肌肉傳導能力。
雖然對衣殼結構的合理修改可能會改善其定向性，但它也可能對衣殼的其他特性(如穩定性)產生負面影響。引入密碼子擴充（codon expansion）和點擊化學技術，對病毒組裝后的衣殼進行修飾。通過利用三重突起的柔韌性，點擊化學氨基酸修飾，在不影響組裝和包裝的情況下，改變衣殼功能。
另一種通過合理設計改善載體轉導的方法是破壞衣殼細胞的降解。定點突變表面暴露酪氨酸殘基，通過抑制蛋白酶體降解和促進細胞內轉運，使小鼠肝細胞轉導增加了近30倍。
盡管引入了高通量篩選方法，合理設計在新載體的工程中始終占有一席之地。例如，最近報道的AAV2真型(AAV-TT)衣殼是通過結合來自血清AAV2陽性兒童的天然AAV2變異體中的保守殘基而設計的AAV-TT比AAV2具有更高的熱穩定性，更重要的是在小鼠中具有良好的中樞神經系統轉導。值得注意的是，AAV-TT也缺乏作為AAV2結合位點的硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)結合基序，這可能是AAV2在培養細胞中適應性選擇的結果。HSPG在細胞外基質中的高表達導致AAV2在非靶組織中的擴散和固存減少，從而限制了AAV2系統傳遞的療效。雖然AAV-TT缺乏通過血腦屏障的能力，但它代表了一種設計合理的衣殼，可能對需要骨髓間充質載體的治療有用。
結構-功能關系的解析，為一些AAV衣殼合理設計中提供了重要的線索。由這種結構信息引導,從天然AAV9衣殼變體中分離出天然AAV9衣殼變體,與原型AAV9不同的黑猩猩組織由4個殘基組成，其中兩個殘基位于3倍的突起處。當這兩個殘基在AAV9上突變時,設計的衣殼，稱為AAV9.HR，在注射小鼠后，AAV9易通過血腦屏障進入大腦，減少進入外周組織。極大地降低了目標從周圍組織中。
定向進化的衣殼
對合理設計方法的一個主要限制是有關AAV細胞表面結合、內化、販運、脫衣和基因表達的知識不足。因此，新的發現方法，即定向進化策略，在許多情況下都是有利的。
定向進化的基礎是模擬自然進化，在這種情況下，衣殼受到選擇性壓力，產生具有特定生物學特性和有利特性的遺傳變異(例如，組織特異性靶向、免疫回避和轉基因表達)。因此，衣殼庫的定向進化并不需要事先了解選擇標準所涉及的分子機制。
另外，在離散區域或整個cap基因上的易錯配PCR也是篩查生成衣殼庫的一種可行方法。最近的許多研究也利用了從預先存在的血清型的初級序列隨機產生嵌合衣殼。與易錯配PCR相結合，衣殼改造可以通過調查具有內在不同取向特征，更廣泛的預先存在的衣殼，從而實現衣殼庫的更大多樣性。值得注意的是，有限針對HIV-1-infected H9 T cells的rAAVs已經進化出來了。
另一個值得注意的定向進化方法是基于Cre重組的AAV靶向進化(CREATE）.這種方法也使用隨機肽片段插入3倍突起，依賴于Cre重組來修復設計到載體基因組中的反式多腺苷化序列。由于Cre重組需要一個雙鏈DNA靶標，只有能夠介導單鏈病毒基因組在胞內有效轉運和轉化為細胞核內雙鏈形式的衣殼，才能在表達Cre的細胞中進行cre重組酶的處理。這一方法導致鑒定了AAV-PHP.B和其他能穿過血腦屏障的衣殼變異體。
隨著下一代測序方法的出現，定向進化已經成為發現新型載體衣殼的一種更加強大的技術。篩選幾千個條形碼轉基因的能力，允許重復富集可以傳遞細胞或組織類型的候選基因。這些技術的唯一真正的限制是，衣殼的進化需要在一個最能模仿目標組織的模型中進行。
硅生物信息學方法
二級、三級和四級結構相互作用，在單體內部和單體之間施加的結構約束，增加了評估未被研究的衣殼結構域的誘變結果時的復雜性。計算工具的使用極大地改進了矢量設計方法，而不需要完全了解AAV衣殼生物學。例如，結合高通量測序，可以使用生物信息工具來設計衣殼變異庫，以確定允許操作的高變異性區域。事實上，在硅質化的新型衣殼工程中，近年來受到了廣泛的關注。例如，在硅質系統發育和統計模擬已知的衣殼序列推斷進化中間體，祖先衣殼序列已經預測了。結果發現Anc80對小鼠肝臟、骨骼肌、視網膜和耳蝸有良好的治療作用。同樣，在幾種有袋類動物的種系內源性病毒元件(EVES)的硅序列分析中，發現宿主DNA內存在病毒整合事件。這些EVEs被描述和重建為新的祖先衣殼，具有潛在的理想載體特性。
rAAV組織靶向基因治療
考慮到AAV的自然取向性和未得到滿足的醫療需求，大多數rAAV基因治療方案側重于肝臟、橫紋肌和中樞神經系統。全身給藥后，幾乎所有的天然AAV衣殼都能有效地傳輸肝臟。因此，rAVVs為治療各種疾病提供了強有力的肝靶向平臺，如血友病a和血友病b、家族性高膽固醇血癥、鳥氨酸轉糖化酶缺乏癥和Crigler-Najjar綜合征。衣殼如AAV8和AAV 9可以針對全身多種肌肉類型，使rAAV基因療法能夠被開發用于多種肌肉疾病，尤其是那些折磨全身肌肉的疾病，如DMD。雖然大多數心臟病是多基因的，并且受環境因素的影響，但有幾個與信號和代謝有關的基因已被測試用于治療心臟衰竭。
臨床開發中rAAV基因治療的很大一部分集中在中樞神經系統上，包括腦區，眼球。眼睛是一個受限制和分隔的器官，可以直接引導rAAV基因的傳遞。值得注意的是，美國食品和藥物管理局(FDA)批準的第一種rAAV基因治療藥物,美國費城生物技術公司Spark Therapeutics開發的藥物“Luxturna”用于先天性黑朦的基因療法治療,治療由RPE65基因突變引起的遺傳性視力喪失患者。相比之下，大腦要復雜得多，體積也要大得多。
直接腦實質內注射rAAV可導致rAAV的局部分布，是治療帕金森病患者中樞神經系統疾病(如帕金森氏癥中的殼核)的理想方法。鞘內注射至腦脊液間隙，可獲得更廣泛的中樞神經系統分布。不幸的是，這些管理途徑可能是侵入性的，并構成很大的風險。或者，靜脈注射某些血清型載體，如AAV9和AAVrh.10，已經允許載體穿過血腦屏障來傳遞神經元和膠質細胞。
這一具有里程碑意義的發現導致了一系列研究，證明了全身性rAAV治療中樞神經系統廣泛分布的疾病的療效，包括脊髓性肌萎縮癥(SMA)、肌萎縮側索硬化癥、卡納文病、GM1神經節苷脂增多癥和粘多糖樣病。利用這種強大的rAAV平臺進行的多項臨床試驗目前正在進行中。