變性凝膠電泳實驗

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乙醇 異丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 變性丙烯酰胺溶液 SDS

電泳儀 注射器 巴斯德吸管 干膠機

1.  制作每塊凝膠時，首先要用肥皂及水小心嚴格地清洗兩塊30 cm×40 cm的前后玻璃平板，用去離子水沖洗后晾干，用噴射洗瓶噴10%乙酵或異丙醇使平板濕海。

2.  然后用Kimwipe紙或其他無絨紙巾將平板擦干。

3.  戴手套在通風櫥工作，用浸濕了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe紙在每片平板的其中一面加一層此溶液，并小心洗擦拭整面平板。

4.  待硅化層干后，用Kimwipe紙以70%乙醇或異丙醇擦凈并干燥，最后再檢查平板有沒有灰塵或其他物質。

5.  按廠商指南用0.2~0.4 mm 均厚的墊片和大的書本裝訂夾子組裝凝膠膠模夾層，注意墊片與平板的邊、底壓緊對齊。

6.  制作每塊凝膠時，在100 ml 燒杯配制60 ml 所需的變性丙烯酰胺凝膠溶液，在灌膠（步驟7）前，徹底混勻60 μl TEMED和0.6 ml 10%過硫酸銨于每份丙烯酰胺溶液中。

7.  立即灌膠，用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入氣泡，讓短平板朝上， 并使凝膠平板夾層與臬面成45度角，沿著平板的一邊慢慢將丙烯酰胺溶液推入兩片平板之間，其間可調整角度讓膠液慢饅流入夾層的一邊。

8.  當溶液達到短平板的頂部時，放下膠模夾層至其頂部邊緣離操作臺平面仍有5 cm 左右，其下墊一空的吸頭盒或其他物件以使之保持較低的角度。

9.  將0.2~0.4 mm 厚的鯊魚齒樣品梳的平齊一側插入膠液中，至短平板下約2~3 mm，操作須十分小心以避免產生氣泡，用一個書本裝訂夾將平極之間的樣品梳夾緊，以避免在掩子與平板間形 成凝膠固塊。

10.  加一層過量的丙烯酰胺溶液至梳子，保證其被完全覆蓋。用水沖洗注射器，除去過量的丙烯酰胺。

11.  除去每片膠模夾層的底部墊片或膠帶，用刀片除去樣品瓶周圍的過量聚丙烯酰胺凝膠。

12.  用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，從每片膠模夾層中撥去鯊魚齒樣品梳，避免拉傷凝膠頂部。

13.  用水清洗梳子，準備好在步驟16操作時重新插回樣品孔。如果用常規樣品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加樣孔，

14.  凝膠電泳裝置的下層貯液槽加入1XTBE緩沖液，使凝膠夾層能浸泡在2~3 cm 的一層緩沖液中，放入凝膠夾層并用夾子固定在電泳裝置上。

15.  上層貯槽倒入1×TBE緩沖液，使超過凝膠頂部約3 cm，用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE清洗凝膠頂部。

16.  將清洗干凈的鯊魚齒樣品梳重新播回凝膠夾層，使其齒部僅可觸及凝膠，用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE緩沖液徹底清洗加樣孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。

17.  加樣前，在45 V/cm 凝膠的電壓降下預電泳，使凝膠預熱，即在1 700 V，70 W 恒功率下電泳約30 min。

18.  在加樣前，清洗加樣孔除去浸進孔中的尿素。

19.  在甲酰胺/染料溶液中的樣品，蓋好蓋子，在95℃加熱2 min，然后置于冰上，每孔加 樣2~3 μl 測序用的加樣吸頭可于每次加樣后在下槽緩沖液中沖洗2次后繼續使用。

20.  在45~70 W 恒功率下電泳，凝膠溫度保持在約65℃。

21.  高于此溫度可能會造成玻璃平板炸裂或條帶彌散，而太低溫度可使測序產物不完全變性、現察標志染料的遷移以確定電泳時間。

22.  將干冰加入干膠機的冷阱并預熱至80℃。

23.  電泳完畢時，排出上下液槽的緩沖液，并按放射性廢物處理丟棄液體。

24.  從電泳裝置中取出凝膠夾層，并在冷自來水下沖洗直至兩面玻璃平板表面都冷卻為止，將夾層平放在紙巾上，四口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液體及夾子、膠帶，取出一邊的墊片。

25.  兩片玻璃平板之間插入一個長金屬鏟子，輕輕轉動鏟于將玻璃 平板橇起使之分開，凝膠應貼在下面的玻璃平板，如果貼在上面的平板，則將它翻轉過來。

26.  從插有鏟子的一邊饅慢提起上面的平板，遂漸增加角度直至上層平板完全與凝膠分離。

27.  一旦平板分離后，取去另一邊的墊片及除去凝膠周圍多余的聚丙烯酰胺碎片。

28.  如果樣品含³²P或³³P，固定步驟可用可不用。如果樣品含³³S，直接將凝膠連同玻璃平板一起放入淺托盤中，輕輕覆蓋一層約2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液，浸泡10~15 min，不時輕輕搖動托盤使凝膠與玻璃平板松開。

29.  將疑膠重新置于平板上，靠吸力或重力除去固定液注意保持凝膠處于平極的中央， 小心從托盤中將平板連同凝膠取出，放在工作平臺上。

30.  將兩張干的轉印紙，疊齊如 同一張一祥，從凝膠的一端開始緩慢地向另一端放下，貼在凝膠的表面，小心防止在紙和凝膠間形成氣泡。

31.  從平板上剝起轉印紙，凝膠應和它一起被揭起，逐漸卷起紙，而凝膠就同它一起被剝離平板。

32.  將濾紙和凝膠放在預熱的干膠機中，上面覆蓋一張保鮮瞑，80℃處理20 min ~1 h，使凝膠徹底干燥。

33.  從干膠上揭去保鮮膜，將干膠放在X光曝光盒中，Kodak XAR-5X光膠片直接與凝膠接觸，室溫放射自顯影，經足夠時間曝光后（一般需過夜）取出X光膠片并沖印。

變性聚丙烯酰胺凝膠中相對于示蹤染料的寡核苷酸的遷移