變性梯度凝膠電泳實驗（一）

實驗原理

DNA 雙鏈分子在全長不斷增加溫度或用化學變性劑條件處理下，兩條鏈就會開始分開（即解鏈）。首先解鏈的區域由解鏈溫度較低的堿基組成。GC堿基對比AT堿基對結合得要牢固，因此GC含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力。解鏈溫度低的區域，通常位于端部稱作低溫解鏈區。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區域便稱作高溫解鏈 (圖1) 。

圖1

如果溫度或變性劑濃度繼續升高，兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據首要的一點是：DNA雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據是，如果某一區域首先解鏈，而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度，其電泳速度也會有明顯差別。因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開（圖 2, 1 和 2 道）。

圖2

最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區堿基錯配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈，后者是在PCR擴增加時產行的。而含有錯配的雙鏈（圖2中的3和4道）通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈（圖2中1和2道）分開，這種分離效果使該方法靈敏度很高。為使僅有一個堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的DNA范圍以及電泳樣品時變性劑濃度梯度。這可以按圖 2 所示的正交變性梯度實驗進行經驗性地解決。變性劑梯度應選在曲線斜率大的部分，因為這時多數分子處于部分變性狀態這使得落入低溫解鏈區的不同分子達到最佳分離。

現在多數分析實驗是加入了“GC夾板”（clamp）。它是將一段長度為30-50堿基，富含GC的DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人為高溫解鏈區。這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區從而可以對其進分析。

實驗材料

1、實驗儀器：電泳控溫槽一臺、電泳支架、程控電泳儀、梯度混合儀一套、緩沖液虹吸泵、凝膠成像儀；

2、實驗試劑：

（1）40%的凝膠單體（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺：37.5/1）：稱取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉雙丙烯酰胺，加入去離子水定容至100ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（2）100%變性劑：取42ml去離子甲酰胺、42g尿素，用去離子水定容至100 ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（3）50×TAE緩沖液（Tris 2mol/L， 冰醋酸 1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0） ；

（4）10%過硫酸銨溶液（W/V，為保證良好的引發效果，建議現配現用） ；

（5）TEMED（分析純）。

（6）梯度變性膠的配方（濃度為8%的變性膠）

（7）梯度變性膠的配方（濃度為6%的變性膠）