變性梯度凝膠電泳（DGGE）

簡  介

　　這個方法是應用最早也是最常用的突變篩查方法之一，在過去的十年中經歷了很大的改進，并被診斷室所廣泛使用，最近有篇關于該問題的綜述（Fodde>和 Losekoot 1994 年）。

原  理

　　如果 DNA 雙鏈分子全長不斷增加溫度或用化學變性劑處理，兩條鏈就會開始分開（解鏈）。首先解鏈的區域由解鏈溫度較低的堿基組成。 G.C 堿基對比 A.T 堿基對結合得要牢固，因此 G. C 含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力（稱作“堆積”）。解鏈溫度低的區域，通常位于端部稱作低溫解鏈區（ lower melting domain ）。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區域便稱作高溫解鏈（ high melting domain ） ( 圖 1) 。如果溫度或變性劑濃度繼續升高，兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據首要的一點是： DNA 雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降（圖 2 ）。第二個根據是，如果某一區域首先解鏈，而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度，因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開（圖 3, 1 和 2 道）。最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區堿基錯配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈，后者是在 PCR 擴增加時產行的。而含有錯配的雙鏈（圖 3 中的 3 和 4 道）通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈（圖 3 中 1 和 2 道）分開，這種分離效果使該方法靈敏度很高。

　　為使僅有一個堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的 DNA 范圍以及電泳樣品時變性劑濃度梯度。這可以按圖 2 所示的正交變性梯度實驗進行經驗性的解決。變性劑梯度應選在曲線斜率大的部分，因為這時多數分子處于部分變性狀態這使得落入低溫解鏈區的不同分子達到最佳分離。

　　為防止對患者樣品分析之前對目標 DNA 片段的經驗性分析占去大量時間，已在本技術的改進人 Leonard Lerman 的實驗室設計了一項計算機程序，程度名叫 MELT87 和 SQHTX ，它可以模擬和任何已知序列 DNA 解鏈溫度有關的解鏈行為。以堿基序列為基礎，程序可以給出解鏈圖象。作為實例血紅蛋白基因的解鏈圖如圖 4 所示。程序還可給出最佳凝膠電泳時間以及任何堿基改變對解鏈圖象產生的預期影響。 MELT87 程序還可以決定是否將多聚 GC 加到 3’ 或 5’ 端的引物上。

　　現在多數分析是用所謂的“ GC 夾板”（ clamp ）技術進行的（見下文）。它是將一段長度為 30-50 堿基，富含 GC 的 DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人工高溫解鏈區。 這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區從而可以對其進分析。這一技術使該方法可檢測的突變比例大大增加。

該方法的發展經過

　　該方法的主要發展階段見表 1 ，其中許多操作今天已普遍使用。本表僅列出該方法的主要的發展經過，包括使用異源雙鏈“ GC 夾板”技術， PCR 及專門的計算機程序等。 PCR 反應技術的問世使非標記技術簡便了許多。

表 1 變性梯度凝膠電泳的發展經過

本方法的不同形式

　　(a) 分析模式。變性劑由甲酰胺 / 尿素變為溫度梯度。一種方法為溫度梯度凝脈電泳（ TGGE ），即在電泳板上保持一溫度梯度，除此而外原理相同。另一方法稱為“溫度橫掃型凝膠電泳（ temperature sweep gel electrophoresis ）”。這回，在電泳過程中逐漸統一提高膠板溫度。在這兩個方法中，化學變性劑的濃度在凝膠上保持衡定（這和通常不斷增高的梯度不同）。而且由于可以避免“緩沖液儲積”現象，所以顯然這樣做是有優點的。（而“經典”的分析方法是在“緩沖液儲積”情況下進行的）。其他形式都是以電泳時條件不變為基礎。在溶液解鏈一法中，雙鏈在含有階梯式升高的變性劑溶液中解鏈，然后用標準的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對解鏈情況進行分析。在恒變性劑凝膠電泳（ CDGE ）（凝膠中的變性劑濃度一致）法中，對待分析片段的分離是在和該片段低溫解鏈區相應的變性劑濃度之下進行的。但這意味著每種待分析片段需要不同的電泳條件，而且該方法可能會在 DNA 片段中檢出未知突變。但除了此方法的發明者及其合作者的實驗外，其他實驗室很少使用這一方法。直到最近才由于毛細管電泳（ Khrapko 等 1994 年）的引入而使其轉向分析應用，并稱作恒變性劑毛細管電泳（ CDCE ）。它是在使雙鏈剛開始解鏈時的恒定化學變性劑和溫度條件下進行分析工作的。毛細管中填充以線性梯度丙烯酰胺（ linear acrylamide ），由激光探測系統檢測標熒光物質的 DNA 分子。該檢測系統快速靈敏可以在 30,000 個堿基序列中檢出一個突變，但如果要對另一不同片段進行分析，前面的條件就必須改變。

　　 每次分析的序列數量在增加。為了用最小量的電泳分析對更長 DNA 片段作突變和多態性篩查，在過去的一段時間里人們已經作了大量努力，其中一則很好的例子是可以將其用于未擴增的人類基因組 DNA （ Gray 1992 年）。一個實驗用 4 種堿基切割酶之一對 DNA 進行消化，然后用變性梯度凝膠電泳技術電泳、迎跡轉移。用放射性物質標記的 DNA 探針對 DNA 進行檢測。因為使用了“ GC 夾板”技術或異源雙鏈技術，所以該方法可用多種探針對薄膜進行多次檢測。雖然此實驗只檢測出了 60% 的突變，但可用另外其他酶對此作部分補償。用第一種酶檢測不出位于高溫解鏈區的突變，但或許用另一種酶作用時可使其落入低溫解鏈區從而得以檢測。更深入的一次篩查更多 DNA 的方法有如對 CFTR 基因（ Costes 等 1993 年）的特定外顯子進行多種途經分析，將多個樣品加到一個電泳道上電泳。另一方法對此作了更大的改進，將苯丙氨酸羥化酶基因的外顯子放在同一凝膠條件的不同電泳道上電泳，而不是將 13 個外顯子放到不同凝膠條件下泳（ Guldberg 和 Guttler1994 年）。這一方法稱作寬幅度變性梯度凝膠電泳（ broadrange DGGE ）。因此用該方法篩查患者突變將會節約一大筆花費（圖 5 ）。將基因組或基因片段分離后進行變性梯凝膠電泳再在另一方向上進行普通電泳同樣可以在一次分析中檢查更多的 DNA （ Uitterlinden 和 Vijg 1994 年）。

　　(c)其他改進。在 PCR 反應過程中加入“ GC 夾板”（ Top1992 年）而不是應用含有“ GC 夾板”的特定引物，這一方法也有可能減少耗費。由一端進行 PCR 反應的引物有：帶有 15bp 堿基接頭的引物和由 15bp 接頭和 35bp “ GC 夾板”構成的接頭 / 夾式引物。當然這就要求一個用特定引物擴增，另一個用帶有“夾板”的引物擴增，而且要用校讀多聚酶（ Proof reading polymerase ）以防止引入人為突變。

　　去除“ GC 夾板”或用化學“夾板”代替可能都會使操作簡便（ Costes 等 1993 年 a ； Fernandez 等 1993 年）。此外，“ GC 夾板”由連接補骨脂的多個堿基 A 替代，經過擴增，它就會與新加上去的配對堿基 T 結合在一起，經光照射后與末端共價連接在一起。現已對此方法進行了深入的研究（ Costes 等 1993 年 b ）。 DNA 片段中特定突變通常會產生特定的異源雙鏈和同源雙鏈圖，所以檢測人員要能夠區分所檢測到的突變是否為以前所描述的突變。但是，兩個或更多突變產生的雙鏈圖可能比較相像，所以要確定檢測出的突變是否為新發現的突變，就可以通過再次分析前加入已知突變樣品（ Guldberg 和 Guttler1993 年）而予以解決。如果已知突變與所檢測到的突變相同，那么就會產生復合雙鏈圖，這種方法可以不用進行序列分析而對突變做出鑒定。

　　Russ 和 Medjugorac(199 年 ) 報道用恒溫平板代替了培養槽。

　　最后，從安全角度出發，Guldberg等人（1994年）介紹了一種方法，將甲酰胺從恒變性劑凝膠電泳中去掉，他們還推測可以將變性劑從變性梯度凝膠電泳中去掉。

　　從此方法發展早期開始，RNA：RNA和DNA：RNA雙鏈就被不時地用來進行分析研究。

突變檢出率

　　運用計算機程序從本方法原理第一條出發可以估計出檢出率，或者用此方法去檢測大量突變也可以估計出檢出率。這兩種方法得到的答案可能不一致，因為，比如說DNA分子周圍序列對檢測結果有影響。

　　估計突變檢出率的研究方法有兩種類型：（a）用盲法檢測100個左右的突變，至少包括所有突變類型中的兩類，（b）對一群基因確有突變的患者進行檢測，(c)未檢突變的記錄。所以至少能從三個層次來討論變性梯度凝膠電泳的突變檢出率問題。不過，隨著檢測方法的發展整個檢出率提高了（表3）。

表3 變性梯度凝膠電泳的突變檢出率，自Cotton(1994年a) 改寫

　　應用“ GC 夾板”變性梯度凝膠電泳技術研究雌激素受體基因時，有一研究小組報道外顯子 1 含有 70%GC 堿基，因為 CpG 區是突變熱點，所以必須用單鏈構象多態技術進行大量的篩查（ Roodi 等 1995 年）。

　　對特定基因突變的患者進行檢查，應用異源雙鏈技術和“ GC 夾板”技術，按照所推薦的方法進行檢測，現在已經清楚如果有突變存在，那么幾乎毫無遺漏地被檢出來。例如，在一項對 44 例血友病 B 患者所作的研究中， 40 例患檢出潛在缺陷，用序列測定法或變性梯凝膠電泳法在其余 4 例中沒有檢出突變。應用此方法分析 308 例丹麥苯丙酮尿癥患者染色體，檢出了 99% 的等位基因突變（其中 32 例為單堿基突變， 3 為例缺失突變）（ Guldberg 等 1993 年）。在輕型或緩和型血友病 A 的例子里，檢測出 26 例已知點突變，用 45 對引物對 99% 的編碼序列進行擴增，檢測出了所有突變（ Higuchi 等 1991 年）。在 29 例患者中檢出了 25 例突變（檢出率為 86% ），不過其他突變可能位于未被檢測的區域（例如內含子）。

　　對用帶有 GC 夾板的異源雙鏈變性梯度凝膠電泳分析所遇到的假陰性問題（即漏掉突變）比較難以找到準確的原因，但如果用來檢測已知突變，那就變得顯而易見了。在 7 例次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（ HGPRTase ）突變實驗中， CDGE （恒變性劑凝膠電泳）法漏掉了一例突變，令人驚訝的是，“ GC 夾板” DGGE 法漏掉了 4 例突變（ Hovig 等 1991 年）。“寬幅度”（ broad range ） DGGE 也被用上去了，所以不清楚是否選用不同引物就可以使這 4 例突變分開，或是因為 DNA 前后序列影響對突變的檢測。在因子Ⅷ基因 GC 堆積的 371bp 片段中報道了同一密碼子上另外的 4 個假陰性突變（ Traystman 等 1990 年），但當該片段降解為 236bp 長的片段后就易于檢測了。

　　看來尚無假陽性的報道，應該注意到可能會檢測出甲基化的堿基（見 Cotton 1992 年 a ）。

　　總之，看來使用 DGGE 結合“ GC 夾板”技術以及使用異源雙鏈技術都可檢出近 100% 的突變，但不能說這 100% 檢出率是由于假陰性得到了證明。這近乎 100% 的檢出率已使此方法成為尋找未知突變的診斷室和許多實驗室的首選方法。

靈敏度

　　對于遺傳性疾病，在給一定位點（該位點突變為雜合狀態）野生型占 50% 的情況下，一個方法要能檢測出 50% 的突變堿基。然而如果要研究嵌合體或癌癥，就必需有更加靈敏的方法，因為這時突變分子所占的比例降低了很多。對于檢測癌癥中小量的殘存性病灶這一點特別正確，要盡可能檢測出最小數量的突變分子。

　　在 DGGE 法中，突變的同源雙鏈分子和另兩種互補異源雙鏈分子完好無損，分離后可用于定量分析和進一步進行其它分析，如測序（而裂解法破壞突變分子）。在某些特定情況下 DGGE 法可以從 100bp 長的序列中檢測出 0.5% 的突變分子（見 Khrapko 等 1994 年）。如果用 CDGE （見前文）法進行分離，分離工作用毛細管電泳完成，通過激光誘生的熒光進行探測，這時可以從 206bp 長的片段中檢測出 0.03% 或 1/3000 的突變分子（ Khrapko 等 1994 年）。在檢測殘留的癌細胞方面，這一方法應該很有用。

突變和鄰近序列效應（ context effects ）

　　到目前為止，已對不同鄰近序列（ contexts ）中 DNA 鏈間所有可能的單堿基差異進行了研究，但沒有對影響檢測的因素作大規模系統的研究。有一項研究使用 TGGE （溫度梯度凝膠電泳）技術檢查最鄰近序列對單堿基錯誤配對穩定性的影響（ Ke 和 Whartell 1993 年）。錯誤配對的鄰近序列可能會影響檢測從而象報道所說的那樣使突變漏掉了。

優點和缺點

　　通常所用 DGGE 法的優缺點見表 4 。盡管有這些缺點，但如決定要用， DGGE 法還不失為一種快速、無放射性的好方法，有 99% 的把握從外顯子大小的 DNA 片段中檢測出突變分子。

表 4 DGGE 法的優缺點

本方法的發展前景

　　由于 DGGE 法突變檢出率高，所以該方法可能已被診斷室用了一段時間了，如果用不同的 DGGE 技術加上“ GC 夾板”方法在一塊膠上可以篩查幾千 bp 長的片段。按照篩查模式來講，那將是比較理想的。從診斷角度考慮，理想的方法是在一塊膠上篩查一位患者所有的外顯子而不是對每一個外顯子用不同的膠板。 Guldberg 和 Guttler(1994 年 ) 的“寬幅度”（ broad range ）凝脈電泳將來可能會受人青睞，但都可能使突變檢出率有所損失，因此，“化學夾板”法可能會被廣泛使用。

　　從兩個方向上使用 DGGE 技術對于檢查整個基因組（ Uitterlinden 和 Vijg1994 年）和腫瘤診斷（ Verwest 等 1994 年）可能會更加重要。同時，將 DGGE 法用于自動化測序儀也有可能。

主要應用

　　Fodde 和 Losekoot （ 1994 年）的綜述給出了 DGGE 技術的大量應用。但，一些主要的應用在表 5 中給出。 DGGE 技術不僅可用于癌癥和遺傳病的篩查及診斷，而且，在癌癥（殘存性病灶、突變圖譜研究等）突變定量實驗中還用以檢測少數突變等位基因。最近有人用來檢測β-地中海貧血，見圖 6 。已有人將大約 150 多個應用列了出來（ BioRad 實驗室 1994 年）。

表 5 DGGE 法十種新近的主要應用

簡要操作步驟

　　下面是用最常用的方法（即篩查外顯子）分析 DNA 片段的操作梗概，其同時使用了“ GC 夾板”和異源雙鏈技術。

　　步驟 1 儀器設備。已在很多場合下對此有所敘述（見下文），但也可以由研究者通過商業途徑獲得或自己制做。簡要地講，把凝膠灌到盒子里然后放入大的加熱培養槽中，加入經充分攪拌的緩沖液。然后，將一個電極（陽極）與這個緩沖液相連，另一個電極（陰極）與上端的緩沖液相接，它可以將凝膠頂部與培養槽或低處緩沖液隔開。現在需要用一個小泵將緩沖液由外面（低處）泵到高處以抵消上端緩沖液向下面的流失。

　　步驟 2 對樣品序列進行分析為篩查作準備。由于使用“ GC 夾板”技術可使多數突變落入低溫解鏈區，所以用計算機程序選擇最佳引物位置就非常重要了，但仍需決定對哪一端連接“ GC 夾板”較好。大多檢測對外顯子和一些內含子的序列都進行了分析，因為多數突變位于外顯子中，而外顯子的大小多在 100-400bp 范圍內，所以可以有效地檢測出突變分子。一旦基因組 DNA 引物位置確定，電泳條件就可由以下兩步確定。（ a ）使用 SQHTX 程序（另一個程序 MELT87 用于預測解鏈區，可作為校對，但如果使用了“ GC 夾板”就無須使用此程序。）這些程序可從 L. Lerman 博士那里得到。（ b ）對樣品進行正交凝膠電泳，見圖 2 ，選擇曲線陡峭部分兩端作為梯度凝膠的化學變性劑濃度范圍。

　　步聚 3 樣品制備。用兩個引的對基因組 DNA 進行擴增，一個引物的 5’ 端連以 40-45bp 富含 GC 的一段序列。因為必須有異源雙鏈形成才能保證檢出率接近 100% ，但由于可能形成突變純合子，所以必須加入等摩爾正常 DNA 分子，以在分析前形成異源雙鏈。

　　步聚 4 制膠。制膠時要選擇梯度范圍，這可用梯度混合器完成，兩個容器分別放有變性劑的極端濃度和合適濃度的丙烯酰胺。

　　步聚 5 電泳。經過電泳和溴化乙錠染色可以很好地分辯 1-2ug 樣品。當溫度平衡到 60 ℃后，移去梳子，加入混合有緩沖液的樣品，電壓控制在 60 到 160V 之間，電泳完后，以標準方法用溴化乙錠染色。

分析所花時間

　　PCR 擴增需要幾小時，凝膠準備 1 小時，電泳 3-6 小時，染色幾分鐘。因此 ，一項檢測分析僅需 7 小時，接到樣品 24 小時后分析就可完成分析工作。

操作步驟參考文獻

　　以下參考文獻，以多種不同的模式詳細說明了如何購買或制作這些裝置以及如何檢測分析樣品，從當前通用的改進方法應用時起，所有方法都寫進了這些參考文獻。

1.Dlouhy等 1991 年。簡要敘述了檢測方法，實驗裝置和所用溶液。

2.Abrams 和 Stanton1992 年。從發展這一方法的實驗室角度，詳細地描述了該方法的原理及實際操作，而且給出了綜述所參考的文獻，所以可能是本方法的權威性敘述。

3.Hovig等 1994 年。這是一本有關人類遺傳學方法手冊中的一個單元，詳細地對 DGGE 法和不太常用的 CDGE 法做了說和明評論。