變性梯度凝膠電泳

1. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50-60 ℃，變性劑0-100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。

2. 為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側引物的5′端加上一個30-40bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處于低熔點區而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。

3.  作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100-500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。

DNA樣品

尿素 去離子甲酰胺 丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺 瓊脂糖 

PCR擴增儀 變性梯度凝膠電泳儀 凝膠成像及分析系統 紫外透射儀 高速離心機 電泳儀 電泳槽 微量加樣器 Tip頭 Tip頭盒 Eppendorf管 Eppendorf管架

1.PCR反應

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。

3.垂直變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0-100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。

PCR產物加上樣緩沖液后上樣，300-400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間2-4小時。

4.平行變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。

PCR產物加上樣緩沖液后，25μl-30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時間3-6小時。

5.染色5分鐘，凝膠成像儀分析結果。

1.  在混合和灌膠時應避免產生氣泡。

2.  有溶液應保存于4℃棕色瓶中，一般幾個月到一年內有效。

3. 電泳時凝膠溫度必須保持恒定，要達到這一要求，可把膠板浸沒于充分攪拌的溫控緩沖液槽內。對于缺乏變性劑時比較容易變性的DNA 來說，槽內的溫度選擇在60℃稍微超過熔點，并且大部分的工作都在60℃下進行（但溫度稍高或低一點都可采用）。溫度保持恒定可將電泳緩沖液加熱到60℃，并把膠浸入其中進行電泳即可。

4.該實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴格操作，做好防護保護自己。

一、實驗過程中的操作細節：

1. 點樣的時候最好用微量進樣器，避免污染和樣品漂浮。

2. 為避免邊緣效應，兩邊可以一定點一些樣品。

3. 制膠是關鍵。玻璃板一定要洗干凈，在灌膠時，要勻速的轉動滑輪，將凝膠液勻速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。