試劑、試劑盒 丙烯酰胺溶液過硫酸銨水溶液去離子水去污劑乙醇KOH 甲醇溶液聚硅氧烷溶液TBE 電泳緩沖液TEMED尿素
儀器、耗材 彈簧夾干膠架封膠帶膠板（配對的） 和隔板手套凡士林保護性的工作合紙鯊魚齒梳子有臂的燒瓶隔板注射器試管架
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
參照附錄 1 配制貯存液、緩沖液、試劑。稀釋貯存液到適當的濃度。
丙烯酰胺溶液（45%m/V）
丙烯酰胺（DNA 測序級） 434 g
N,N'-亞甲雙丙烯酰胺 16 g
加水 至 600 ml
加熱至 37°C 以促進溶解用蒸餾水調至 1 升，用硝酸纖維素膜過濾（孔徑 0.45ptn). 室溫貯存于棕色瓶中。另外一種較為昂貴的方法是購買預先混合好的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末，再用水溶解。便宜的丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺粉末通常混合有金屬離子。由此配置的貯存液需要純化，方法是，與 0.2體積的樹脂（MB-1,Mallinckrodt) 混合攪拌，再用 Whatmenl 號紙過濾。貯存中，丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺會緩慢的變成酸性，這個脫氮基過程由光和堿催化。保持溶液 pH 值在7.0 或者以下，在黑色瓶中保存于室溫應該每幾周重配一次。
過硫酸銨水溶液（1.6%m/V)
去離子水
去污劑
乙醇
KOH/甲醇溶液
在 100ml 甲醇中加入 5 gK0 H 配成，用于清洗玻璃板，貯存在密閉的玻璃瓶中。
聚硅氧烷溶液
傳統的聚硅氧烷溶液中包括二氯二甲基硅，它有毒性、揮發性并且易燃。近年來，出現了一些無毒的替代物，包括 Gel Slick(FMC Bioproducts)、RainX(Unelko，Scottsdale Arizona), 和 Acrylease(Stratagene)。
10XTBE 電泳緩沖液
TBE 在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的濃度是 lx(89 mmol/L Tris-硼酸，2 mmol/L EDTA)，這一濃度是瓊脂糖電泳用量的 2 倍（請見第 5 章）。用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的垂直電泳槽的緩沖液池一般較小，故所通過的電流量通常相當大。要用 lxTBE 才能夠保證適當的緩沖容量。緩沖液的 pH 值應接近8.3。一般無須調 pH 值；可是，對于每次新配的 10XTBE 電泳緩沖液都要認真檢査 pH 值。
使用同樣的 10xTBE 電泳緩沖液配制膠和工作緩沖液，因為兩者之間微小的差異也會導致 DNA遷移時嚴重扭曲。
使用氨基乙磺酸（36 g/L 的 10XTTE 緩沖液） 取代標準 TBE 溶液中的硼酸可以減少由于形成甘油-硼酸陰離子脂類化合物而導致的在膠的頂部的條帶扭曲<Pisa-Willanson and Fuller1992)。若需要更多的信息請參見 DNA 測序反應中的甘油一節。
TEMED(N,N，N',N'-四甲基乙二胺）
電泳級的 TEMED 在很多公司有售（Sigma,Bio-Rad),TEMED 容易吸潮，必須 4°C 貯存在密閉的瓶中。它是聚合反應中的連接催化劑。
尿素，固體
特殊裝置
彈簧夾：5 cm 長，每塊膠 5 到 7 個。
干膠架
雖然不重要，干膠架對于干燥和貯存測序用的玻璃平板是非常方便的（Bio Whitraker)。
封膠帶
例如 3M Scotch Stretchable Tape(Lab Safety Supply,Janesville，Wisconsin)，3M Scotch yellow electrical tape#56(Life Technologies),3M Scotch polytetrafluorethylene(PFTE)extruded film tape。關于不同種膠帶的用法和其他封膠的方法，參見 Hengen(1996)。
膠板（配對的） 和隔板
制膠的板一塊比另一塊略長 3.5-4.0 cm, 或者有一塊板是缺刻的。為避免膠板裂了或者漏了，最好保持板是配對的并且和測序膠的槽相對應。
手套
無滑石粉、易處理的橡膠或者聚氯乙烯（PVC)。
凡士林
可選擇，見步驟 4
保護性的工作合紙
一面是塑料的（Kaydry Lab Cover from Fisher) 或者 Benchkote。
鯊魚齒梳子
0.4 mm 厚,32,64 或 96 齒. 依賴電泳裝置的能力。
有臂的燒瓶（250 ml)
隔板（厚度一致或者邊緣較窄）
每膠兩板，由有彈性的薄塑料板（0.4 mm) 或特氟隆（Sanger and Coulson 1978） 制成，使玻璃板隔開。在膠板和隔板之間形成不透水的封口，使未凝固的膠溶液不會漏出。
邊緣窄的隔板用于制造底部比頂部厚的膠，使底部的條帶比較窄并且整塊膠的條帶比較均勻。雖然它有這樣的優點，但是比較難以制備和干燥。
注射器（60cc)
可選擇，見步驟 15.
試管架
55°C 水浴
方法
重要：為防止皮膚油脂的污染. 必須一直帶無滑石粉的手套，并且只能拿板的邊沿。
準備膠板
1. 必要時，甩 KOH/甲醇清洗板上的舊污漬。
2. 然后用溫的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，用自來水徹底沖洗，再用去離于水洗凈。用乙醇沖洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干。
必須小心翼翼地洗凈玻璃板. 以確保灌膠時不會產生氣泡。
3. 小塊玻璃板的內面用聚硅氧烷溶液處理。在化學通風櫥內將玻璃板放在一疊紙巾上, 內表面向上，在上面傾倒少量硅烷化液。用幾張 Kimwipes 紙在玻璃板表面將硅烷化液涂布均勻，讓玻璃板風干（l~2 min）。然后用去離子水洗，再用乙醇洗，風干。
4. 把大塊玻璃板（干凈面朝上）放在空的試管架上，把隔片放在玻璃板的兩邊（見圖12-9)。
如果用邊沿窄的隔片，把厚的一邊放在板的底部。在大板和隔片之間加入小滴凡士林使隔片在下一步時不會移動。
5. 再將較小（或帶凹口）的玻璃板在間隔片上放置妥當，對齊隔片。
6. 用若干個大彈簧夾（長 5 cm) 將玻璃板的一邊夾起來。
在玻璃板另一邊及玻璃板底部貼上凝膠密封帶，形成不透水密封，必須特別注意玻璃板的底角，因為這是最容易發生滲漏的地方。
7. 將彈簧夾換到已封好的一邊，在玻璃板的另一邊貼上凝膠密封帶。
8. 將梳子放在膠模的敞開端并檢査是杏貼切適合，取出梳子將空膠模放在實驗桌上。
配膠
9. 在實驗桌的工作區上鋪上襯塑料的保護紙。
灌制測序凝膠時幾乎不可能避免將丙烯酰胺溶液滴于桌面。
10. 在一個 250 ml 有臂錐形瓶中配制適當濃度的丙烯酰胺溶液（表 12-19)。這些溶液足夠配制一塊 40 cmx40 cm 的測序凝膠。
注意：凝膠的配制必須一氣呵成，中間不能斷斷續續。
11. 混合所有試劑，在 55°C 水浴中加熱 3 min 幫助尿素溶解。
溶解尿素的過程十分緩慢，必須依靠外部的熱量。大約的體積是 66 ml, 加水到 100 ml。
12. 從水浴中取出溶液，冷卻 15 min 至室溫。不斷攪拌混合物。
13. 把燒瓶放在真空裝置里抽去氣體。
防止聚合時產生氣泡。
14. 把溶液放入 250 ml 玻璃燒杯中。加 3.3 ml 新制的 16% 的過硫酸銨，混勻。
舊的硫酸銨沒有足夠的聚合能力，會產生模糊的條帶。
15. 加 50ulTEMED，輕輕旋動容器以混勻溶液。直接配膠。或者用 60cc 注射器吸取上述溶液約 40 ml。注意，不要有氣泡。
與蛋白電泳相比，已經使用了最大量的 TEMED，確保了聚合足夠快和足夠均勻。聚合速度與時間有關, 溫度越低聚合越慢。有經驗的人利甩預冷卻的方法可以用一次配制的混合物制成多塊 40 cmx40 cm 膠。
從此步開始，動作盡可能迅速。
16. 用手托住膠模使之與水平面大約成 45°角，沿一邊從移液管中緩緩灌入溶液（參見圖 12-9)。