口蹄疫聚合酶鏈反應（PCR）

20世紀90年代初，PCR技術日趨成熟，也滲入到FMD的診斷中。這一技術特異性強，靈敏度高，可檢測多種組織樣品，檢測病毒RNA的PCR方法已經成為FMDV檢測方法中的一種，PCR方法具有極高的靈敏度（其理論值為一個病毒粒子的核酸），因為它僅需要極少量的反應模板，而且可以設計多循環PCR反應。由于僅將RNA的目的片段擴增出來所以也具有很好的特異性。PCR檢測提供了適合于對應序列的基因物質，提供了較為詳細的流行病學信息，為疫源的追蹤提供了可靠的理論依據；

近年來隨著PCR技術的不斷成熟，該技術在檢測FMDV方面也有了較大的進展。這種方法不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。RT-PCR和DNA序列分析相結合進行病毒核酸序列分析是zui具權威性的分析毒株異同的方法，應用PCR診斷FMDV，以特殊設計的引物作介導及在反轉錄酶的作用下再進行PCR擴增，擴增產物用PAGE、瓊脂糖電泳或硝酸銀染色檢查，看擴增出的DNA片段大小與設計是否相符。用此技術診斷FMD的報道始見于1991年，Meyer等根據編碼FMDV RNA的多聚酶基因序列（此段為FMDV 7個血清型的高度保守區）設計合成一對引物和探針，經RT-PCR擴增，獲得454bp擴增產物，用寡核苷酸探針雜交顯示強陽性反應，NcoI酶切證實了預計限制性位點。Laos等在變化的VPl基因序列中選擇引物，則可用于鑒別FMDV以色列株。選擇使用不同的引物，可以達到診斷和定型FMDV的目的。迄今已有美國、英國、西班牙等國家和地區報道了PCR在FMD診斷中的研究及應用，國內吳時友等就FMDV的PCR檢測研究作了報道。朱彩珠等也將此項技術應用于FMD的診斷，可檢測出20倍TCID,。（細胞毒）或0．16—0．32倍LD和（組織毒）的病毒量。該法特異性好，檢測靈敏度高，可以檢測病毒也能直接檢測核酸片段，樣品可以是水皰液也可以直接用扁桃體、淋巴結、肌肉和蹄、皮膚等組織，這是免疫學方法無法替代的，此方法需要較高的實驗設備和熟練的分子生物學實驗操作技能，到目前為止，尚未在檢疫中推廣應用，僅限于專業實驗室應用。

選擇一對適合于FMDV所有血清型及亞型的引物對是zui首要的問題，所設計的引物需能夠將與FMD臨床癥狀相似的小核糖核酸病毒區分開來。引物序列需在基因的高度保守區進行選擇，例如：沒有結構蛋白RNA聚合酶和5，端不翻譯區域。當設計分型引物時，通用型引物需設計在VPl 3’末端的高度保守區，設計出的引物能夠成功的將7種血清型的此區域擴增出來。VPl結構蛋白主要反應了FMDV不同血清型的變化，同時對于不同的FMD分離株，可以進行VPl基因編碼區的序列分析，建立系統生發樹。雖然序列分析是一種非常權威的流行病學調查工具，但是在實施免疫策略的時代，并不是所有的毒株都可以得到相應的序列并進行序列分析。

然而，事實證明對牛進行FMDV檢測時RT-PCR檢測效果不亞于病毒分離，因為組織內積極的中和反應很可能會影響感染病毒的復制。

巢式PCR作為一項更加靈敏、更特異的檢測方法已經被研制成功。但巢式PCR在推廣上存在著弊端，原因有兩種情況：*種情況，巢式PCR方法很容易出現假陽性，因為PCR操作的實驗室環境可能被少量的特異性的核酸片段所污染；第二種情況，由于此技術需要昂貴的試劑和熟練的操作人員，因此它變成了一項復雜的、限制性很強的技術。

FMD的控制主要是依賴前期的診斷，快速、有效的檢測方法一直都是所有研究和檢測所必需的。生物感受器、實時RT-PCR也已經開始被研究和應用。

M．Scott等為了彌補常規診斷的不足，通過提高PCR方法檢測靈敏度和檢出率，對實時RT-PCR檢測方法作了進一步的研究。實時RT-PCR檢測法較普通的RT-PCR方法快捷且減少了污染的可能性。同時ELISA、病毒分離能夠與實時RT-PCR檢測方法平行應用于FMD的鑒別診斷，在FMDV的檢測中實時RT-PCR檢測方法起到了有效的輔助作用。