葉綠體色素理化性質測定

【原理】  

葉綠素是一種二羧酸—葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的二羧酸酯，故可與堿起皂化反應而生成醇(甲醇和葉綠醇)和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開；葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，具有各自特異的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定；葉綠素吸收光子而轉變成激發態，激發態的葉綠素分子很不穩定，當它變回到基態時可發射出紅色熒光。

葉綠素的化學性質很不穩定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩定。葉綠素中的鎂可以被H＋所取代而成為褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。

皂化反應式如下：

C32H30ON4MgCOOCH3COOC20H39+2KOHC32H30ON4MgCOOKCOOK+
CH3OH+C20H39OH

皂化葉綠素甲醇葉綠醇

【 儀器與用具】  

20Ml刻度試管；10Ml小試管；試管架；分光鏡；石棉網；藥匙；燒杯(100Ml)；酒精燈；玻棒；鐵三角架；刻度吸量管2ml、5Ml各1支；火柴。

【 試劑 】  

95％乙醇；

苯；

醋酸銅粉末；

5％的稀鹽酸；

醋酸—醋酸銅溶液：6g醋酸銅溶于100Ml 50％的醋酸中，再加蒸餾水4倍稀釋而成；

KOH—甲醇溶液：20g KOH溶于100Ml甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的 試劑 瓶中。

【方法】  

用本實驗第一項中提取的葉綠體色素乙醇溶液和葉綠體懸浮液，進行以下實驗。

1光對葉綠素的破壞作用

(1)取4支小 試管 ，其中2支各加入5Ml葉綠體懸浮液，另外2支各加入25Ml葉綠體色素乙醇提取液，并用95％乙醇稀釋1倍。

(2)取1支裝有葉綠素乙醇提取液的 試管 和1支裝有水研磨葉片勻漿的試管，放在直射光下，另外2支放到暗處，40Min后對比觀察顏色有何變化，解釋其原因。

2熒光現象的觀察取1支20Ml刻度試管加入5Ml濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同解釋原因。

3皂化作用(綠色素與黃色素的分離)

(1)在做過熒光現象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入15Ml 20％KOH—甲醇溶液，充分搖勻。

(2)片刻后，加入5Ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1～15Ml蒸餾水，輕輕混勻(勿激烈搖蕩)，于試管架上靜置分層。若溶液不分層，則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動，直到溶液開始分層時，靜置。

可以看到溶液逐漸分為兩層：下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素A和B(以及少量的葉黃素)；上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。

4吸收光譜的觀察將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對準進光孔，看光譜有何變化；然后再將上層的黃色素溶液對準進光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結果用簡單的圖表示出來。

5H＋和Cu2＋對葉綠素分子中Mg2＋的取代作用

(1)取2支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2Ml，作為對照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5Ml，再加入5％HCl數滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。

(2)當溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。

(3)另取醋酸—醋酸銅溶液20Ml，以燒杯盛之。取新鮮植物葉片2片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因。

【注意事項】  

1在低溫下發生皂化反應的葉綠體色素溶液，易乳化而出現白色絮狀物，溶液渾濁，且不分層。可激烈搖勻，放在30～40℃的 水浴 中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。

2分離色素用的圓形 濾紙 ，在中心打的小圓孔，周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個同心圓。