葉綠素的理化性質測定實驗

實驗方法原理：葉綠素是一種二羧酸的酯，可與堿起皂化作用，產生的鹽能溶于水，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。葉綠素與類胡蘿卜素都具有共軛雙鍵，在可見光區表現出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子后轉變成的激發態葉綠素分子很不穩定，當它回到基態時，可以發出紅光量子，因而產生熒光。葉綠素的化學性質也很不穩定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離后，破壞更快。葉綠素分子中的鎂可被H+所取代而成為褐色的去鎂葉綠素，后者遇到Cu2+可形成綠色的銅代葉綠素，這種葉綠素在光下不易受到破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸制標本。

實驗材料：

菠菜葉                                                                  

木瓜葉

試劑、試劑盒：

95﹪酒精                                                                  

KOH甲醇溶液                                                                  

醋酸                                                                  

苯                                                                  

醋酸銅粉                                                                  

碳酸鈣                                                                  

石英砂  

儀器、耗材：

天平                                                                 

分光鏡                                                                  

小電爐                                                                  

試管                                                                  

量筒                                                                  

移液管                                                                  

研缽                                                                  

小燒杯                                                                  

漏斗等

實驗步驟：

1. 葉綠體色素提取

稱取新鮮葉片2g剪碎于研缽中，加少量95﹪酒精（或80﹪丙酮）和少量CaCO3粉及石英砂，研磨成勻漿，再加95﹪酒精（或80﹪丙酮）l0ml稀釋研磨后，用濾紙過濾于小瓶中，濾液即為葉綠體色素提取液。

2. 葉綠素的皂化作用（綠色素與黃色素的分離）

（1） 用移液管吸取葉綠體色素提取液約5ml放入試管中，再加入1.5ml左右20﹪KOH甲醇溶液,充分搖勻。

（2） 片刻后，加入5ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1～1.5ml蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），靜置試管架上，可看到溶液逐漸分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化葉綠素a和b（以及少量葉黃素），上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。

3. H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代作用

（1） 吸取葉綠體色素提取液約5ml放入試管中，加入30﹪醋酸數滴，搖勻，觀察溶液顏色的變化。

（2）當溶液變褐色后，傾出一半于另一試管中，投入幾粒醋酸銅粉，微微加熱，觀察溶液顏色變化，與未加醋酸銅的一管相比較。

（2）解釋上述顏色變化過程，并列出其反應式。

4. 葉綠素的熒光現象

取比較濃的葉綠素提取液5ml放入試管中，在直射光下觀察溶液的透射光及反射光

的顏色有何不同？試述其原因。

5. 光對葉綠素的破壞作用

（1）取兩支試管，各加入經稀釋的葉綠體色素提取液5ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗處，1～2 h后觀察二管溶液顏色有何變化。

（2） 另取上述實驗Ⅰ中用紙層析法分離成的色譜兩張，一張放在直射光下，另一張放在黑暗中。約1 h以后比較兩張色譜上四種色素的顏色各有何變化。

（3） 解釋以上結果。