絲氨酸蛋白酶的特點是具有獨特的結構，由兩個在催化活性位點會聚的β-桶結構域組成。這些酶可以根據它們的底物特異性進一步分類為胰蛋白酶樣、胰凝乳蛋白酶樣或彈性蛋白酶樣。
胰蛋白酶樣
胰蛋白酶樣蛋白酶在帶正電荷的氨基酸（賴氨酸或精氨酸）之后切割肽鍵。這種特異性是由位于酶S1口袋底部的殘基驅動的（通常是帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸）。
胰凝乳蛋白酶樣
胰凝乳蛋白酶樣酶的S1口袋比胰蛋白酶樣蛋白酶更疏水。這導致對中到大尺寸疏水殘基的特異性，例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
類凝血酶
這些包括凝血酶、組織激活型纖溶酶原和纖溶酶。已發現它們在凝血和消化以及神經退行性疾病（如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏誘發的癡呆癥）的病理生理學中發揮作用。
類彈性蛋白酶
彈性蛋白酶樣蛋白酶的S1裂縫比胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶小得多。因此，殘基如丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸往往是優選的。
枯草桿菌蛋白酶
枯草桿菌蛋白酶是原核生物中的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶在進化上與胰凝乳蛋白酶家族無關，但具有相同的催化機制，利用催化三聯體來產生親核絲氨酸。這是用來說明趨同進化的經典例子，因為同一機制在進化過程中獨立進化了兩次。