提純方法：采用酶進行轉化，將合成得到的DL-肉堿先進行乙酰化制成酰胺或腈等，然后利用微生物來源的酶進行選擇性水解拆分。如用假單胞菌等微生物的酰胺酶選擇性水解DL-肉堿酰胺或肉堿腈，可制得光學純度99%以上的L-肉堿。
擴展內容：化學法合成左旋肉堿早期通過直接合成DL-混旋體作原料，利用各種拆分劑析出左旋體，后來使用催化劑選擇性拆分環氧氯丙烷選出左旋環氧氯丙烷用于合成左旋肉堿，其中發現S-(Salen) Co（Ⅲ）催化劑對環氧氯丙烷的水解拆分效果最佳，但過程中存在使用含氰有毒物質、拆分劑及催化劑價格偏高，拆分分離開的另一半旋光體如何利用、反應步驟多、收率低、成本高、產品價格高等問題，為此也出現過很多優化方法的研究，例如使D-肉堿酯化形成內鹽然后加氫還原水解得到L-肉堿、通過氧化還原的方法將D-肉堿上的羥基氧化為沒有手性的羰基再還原出L-肉堿、將合成時使用的S-(Salen) Co（Ⅲ）催化劑固載在各種聚合物上以便進行循環利用、對選擇性拆分的剩余物進行回收利用、以及使用生物化學方法尋找環氧水解酶對環氧氯丙烷進行手性拆分。總的來說，將微生物法和化學合成法相結合，避免使用氰化物的路線，效益最好。另外，也有研究使用其他手性原料直接化學合成左旋肉堿，例如使用維生素C 、D-蘋果酸、L-抗壞血素和L-阿拉伯糖等。還有研究成功以氯乙酰乙酸乙酯為原料經不對稱催化氫化制得高光學純度的(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，進而轉化為左旋肉堿。