合成5＇加帽轉錄物

DEPC處理的水   轉錄緩沖液   lOOmmol LDTT   RNasin   rATP rCTP rUTP rGTP0.5 mmol L   m7 G(5＇)ppp(5＇)G   DNA 模板   RNA 樣品緩沖液   RNA 載樣緩沖液   MOPS 緩沖液   TE 緩沖液

一材料與設備

1)DEPC：處理的水

2) 轉錄緩沖液（5X):200 mmol/LTris-HCI(pH7.9),30 mmol/LMgCl2,lOmmol/L. 亞精胺，50 mmol/LNaCl

3)lOOmmol/LDTT

4)RNasin

5)rATP,rCTP，rUTP，各 2.5 mmol/L

6)rGTP0.5 mmol/L

7)m⁷ G(5＇)ppp(5＇)G,5 mmol/L

8)DNA 模板，1?2 mg/ml

9)RNA 樣品緩沖液：10 mmoL/I. 去離子甲酰胺，3.5 ml37% 甲醛，2 mlMOPS 緩沖
液

10)RNA 載樣緩沖液:50% 甘油，lmmol/LEDTA，0.4% 溴酚藍,lmg/ml 溴化乙錠

11)MOPS 緩沖液：0.2 mmol/LMOPS(pH7.0),50 mmol/L 乙酸鈉,5 mmol/LEDTA(pH8.0)

12)TE 緩沖液


二操作方法

1) 體外轉錄生成 RNA

在無菌離心管中，室溫下加入下述成分:

5X 轉錄緩沖液                                                4ul

100 mmol/LDTT                                              2ul

RNasin20U

rATP,rUTP,rCTP(各 2,5 mmol/L)                        4ul

GTP(O.5 mmol/L)                                            2ul

m⁷ G(5＇)ppp(5＇)G(5 mmol/L)                         2ul

DNA 模板 (1?2 mg/ml)                                   1-2ug

加無核酸酶的水至終體積                                  19ul

2) 起始反應加入 1ul SP6、T7 或 T3RNA 聚合酶（15?20U/ul)。

3)37?40℃ 孵育 60 min。

4) 按 RNA 標準轉錄反應所述的方法除去 DNA 模板，純化 RNA 轉錄物。