收集細胞，用 D-PBSA 洗滌，重新制成 5×107個/ml 的細胞懸液，制備細胞抽提物并置于 -70°C 保存。準備凝膠裝置，取 1~2 μl的細胞抽提物、標準品及對照點樣于瓊脂糖凝膠。槽內充滿液體，將瓊脂糖凝膠置于其中，電泳 25 min，加入酶反應試劑，孵育 5~20 min 后，沖洗凝膠，干燥，檢査已完成的凝膠酶區帶的顯示。
| 實驗方法原理 | 收集細胞，用 D-PBSA 洗滌，重新制成 5×107個/ml 的細胞懸液，制備細胞抽提物并置于 -70°C 保存。準備凝膠裝置，取 1~2 μl的細胞抽提物、標準品及對照點樣于瓊脂糖凝膠。槽內充滿液體，將瓊脂糖凝膠置于其中，電泳 25 min，加入酶反應試劑，孵育 5~20 min 后，沖洗凝膠，干燥，檢査已完成的凝膠酶區帶的顯示。 |
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| 實驗材料 | 細胞抽提物酶底物核苷酸磷酸化酶（NP)6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD)蘋果酸脫氫酶（MD）乳酸脫氫酶（LD)天冬氨酸氨基轉移酶（AST)6-磷酸甘露糖異構酶（MPI)肽酶B(Pep B) |
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| 試劑、試劑盒 | 細胞抽提緩沖液或Triton X-100抽提溶液緩沖液SAB8.6D-PBSA蒸餾水去離子水 |
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| 儀器、耗材 | Authentikit裝置和試劑瓊脂糖凝膠膜SAB8.6孵育盤襯墊孵育盤染色或洗滌盤溫度控制室的槽蓋和槽底定時電泳儀安全連接器孵育室或干燥器配有1英寸長磁力棒的磁力攪拌器樣品加樣器Teflon 頭凝膠記錄表酶遷移數據表細胞I.D.最終分析表微升注射器微量離心機Eppendorf 管加樣器加樣器吸頭移液管100ml帶刻度的量筒記號筆防護手套裝吸頭的垃圾桶 |
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| 實驗步驟 | 一、抽提物的制備
1. 按常規方法培養細胞達 2×107 個活細胞。
2. 依照具體細胞系實驗推薦的方法收集細胞。
3. 細胞團重懸于 D-PBSA 中，計數活細胞。
4. 細胞懸液以 300 g 離心 5~10 min 沉淀細胞，傾去上清液。
5. 重復步驟 3 和 4 , 總共洗滌細胞 3 次。
6. 向細胞團塊中加人 100 μl 抽提液（細胞抽提緩沖液（Innovative Chemistry，Inc） 或 Triton X-100 抽提溶液：1:15（V / V），Triton X-100 溶于生理鹽水，包含 6.6×10-4 mol/L EDTA，pH 7.1（4℃保存））。
7. 小心地將細胞懸液吸取至小容量移液管中，上下吹吸直至全部細胞裂解。
8. 將細胞裂解液移至 Eppendorf 管（1.5 ml）中，用移液管上下吹吸數分鐘直至細胞膜成云霧狀并集結在一起，用微量離心機（microfuge） 以最高速度 （約 9000 g ) 離心細胞裂解液 2 min ，收集上清液，等分為所需體積，-70°C 保存。
二、安裝電泳裝置
1. 打開孵育箱電源。
2. 每個孵育盤內放一個盤墊。
3. 在每個孵育盤中加人 6.0 ml 去離子水，37°C 保溫 20 min。
4. 向電泳槽每個盤室中加入 95 ml SAB 8.6 緩沖液（整個電槽中緩沖液的總體積為 190 ml） 該緩沖液不可重復使用，因為電泳過程中 pH 值會有顯著改變。
5. 將裝了緩沖液的電泳槽通過安全連接線與電壓可調的電源連接，電源接地。
6. 將每個溫控電泳室蓋表面充滿 500 ml 冷水（4~10°C )。電泳蓋一定要在垂直放置時裝滿水，否則水將流失。用冰將水冷卻或在冰箱中貯備足夠的冷水，每次電泳前要更換冷水。
7. 在每種染色盤中加 500 ml 去離子水或蒸餾水，并用它洗滌孵育盤。這些水不能重復使用。
三、電泳步驟
1. 標記每塊待用瓊脂糖凝膠。可用 Innovative Chemistry，Inc 的標簽或用永久性記號筆在凝膠背面作個記號。
2. 將凝膠放在臺面上，塑料突起向下。調整凝膠方向使樣品孔離操作者最近。
3. 標記每個樣品孔，標明將被檢測的樣品，（如：標準、對照、未知 1、未知 2 等）每塊凝膠可檢測 6 個未知樣品。
4. 將瓊脂糖凝膠從堅硬的塑料支持物上小心地剝離。沿著邊緣小心處理凝膠，棄去硬塑料支持物。
5. 向樣品孔加入細胞抽提物。用裝有 Teflon 頭的分液器將 1 μl 細胞抽提物精確地加到每個孔中。每個樣品用一個新的頭。將分子量標準品點樣于泳道 1，對照點樣于泳道 2，未知點樣于泳道 3~8。為避免損傷瓊脂糖，只有細胞抽提液滴可接觸樣孔，點樣器尖不能碰孔。若點樣量為 2 μl，在第 1 μl 樣品散到瓊脂糖內后再點第 2 滴。
6. 將每個已點樣的瓊脂糖膠插入電泳槽蓋上，瓊脂糖面向外。將瓊脂糖膠的陽極（+ ) 與電泳槽蓋的陽極（+ ) 匹配，可能需將瓊脂糖凝膠輕微彎曲以便插入電泳槽蓋。
7. 在每個電泳槽座上放一個電泳槽蓋。內部有磁鐵的黑端最靠近電源。打開電源（160V），定時 25 min 。
8. 在電泳結朿前大約 5 min 時，從冰箱中拿出每種底物試劑瓶，使其恢復到室溫。
9. 臨用前加入 0.5~1 ml 去離子水至每個試劑瓶中，輕輕地旋轉小瓶使試劑溶解。
10. 電泳結束時，從電泳槽座上拿開電泳槽蓋并將其置于吸水紙上。
四、染色步驟
1. 從電泳槽室中取出瓊脂糖膠，抓住凝膠膜邊緣，向內輕壓便可將其從蓋中取出。
2. 將瓊脂糖凝膠側立，置于水平放在平面上的吸水紙上，點樣孔朝向操作者。
3. 仔細地用不起毛的吸紙吸去瓊脂糖膠兩端殘余的緩沖液。
4. 沿著瓊脂糖凝膠膜底邊放置一支 5 ml 的移液管。
5. 沿著移液管的前緣將重新制備的底物均勻傾倒于瓊脂糖膠上。
6. 用平滑的動作推動吸管經過瓊脂糖表面，一次完成，再向操作者方向拖回吸管，在瓊脂糖表面推多次，吸管滾動著離開瓊脂糖末端，在此過程中移去多余的物質，注意不要破壞瓊脂糖凝膠，此步無需加壓。
7. 將邊緣整齊的瓊脂糖膠放在預熱的孵育器盤中，瓊脂糖面向上，并把盤置于 37℃ 孵箱內 5~20 min 。
8. 孵育后，用 500 ml 雙蒸水或去離子水清洗瓊脂糖膠兩次，用磁力攪拌棒攪動，每次 15 min，第一個 15 min 后，取出每個凝膠膜，將水棄去，加入 500 ml 新鮮水于器皿中，將凝膠膜浸人水中，并予以遮蓋避光，確保凝膠膜完全浸入而不是在漂浮清洗液上。
9. 從水中取回凝膠膜，將其放置于孵箱或烤箱烘干室的烘干架內，烘干 30 min 或直到瓊脂糖膠干燥，也可將瓊脂糖膠室溫干燥過夜。
10. 清潔整理，倒掉電泳槽底緩沖液，并用蒸餾水沖洗，將電泳梢蓋中的水倒出，沖洗槽蓋內部，并晾干。
11. 結果評價，區帶是永久性的，凝膠膜也可保存起來，便于將來參考，如果隨時間延長，出現背景染色，說明凝膠清洗不夠充分。 展 |
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