聽力損失研究迎來新進展復旦等團隊使用了這一方法

　　CRISPR/RfxCas13d (CasRx) 編輯系統可以特異性和精確地切割單鏈 RNA，通過下調相關基因表達來治療各種疾病是一種很有前途的治療方法。

　　2022年3月14日，復旦大學舒易來，李耕林及中國農業大學胡曉湘共同通訊在Signal Transduction and Targeted Therapy （IF=18）在線發表題為“Preventing autosomal-dominant hearing loss in Bth mice with CRISPR/CasRx-based RNA editing”的研究論文，該研究在Beethoven (Bth) 小鼠上測試了這種 RNA 編輯方法，這是一種人類 DFNA36 的動物模型，由于 Tmc1 中的點突變。該研究首先在細胞培養物中篩選了 30 種 sgRNA，發現帶有 sgRNA3 的 CasRx 使 Tmc1Bth 轉錄物減少了 90.8%，Tmc1 野生型轉錄物 (Tmc1+ ) 減少了 44.3%。然后，該研究將新開發的基于 AAV 載體 (AAV-PHP.eB) 的 CasRx 注入新生 Bth 小鼠的內耳，發現 Tmc1Bth 在 2 周內減少了 70.2%，在整個轉錄組中幾乎沒有脫靶效應。

　　始終如一地，該研究發現毛細胞存活率提高，毛束退化得以挽救，機電轉導電流降低。重要的是，以 ABR 和 DPOAE 閾值衡量的聽力表現在 8 周內所有年齡段的小鼠都有顯著改善。因此，該研究已經驗證了基于 CRISPR/CasRx 的 RNA 編輯策略在治療常染色體顯性遺傳性聽力損失中的作用，為其在聽力及其他許多其他遺傳性疾病中的進一步應用鋪平了道路。

　　另外，2022年2月23日，復旦大學舒易來，李華偉，中國科學院上海神經科學研究所楊輝及中國農業科學院左二偉合作在Cell Research 在線發表題為“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究論文，該研究基于同源介導的末端連接 (HMEJ) 的策略，修復了小鼠（Klhl18lowf 小鼠）常染色體隱性聽力損失障礙。該研究的概念驗證結果顯示了進一步開發基于 HMEJ 的策略來修復導致遺傳性聽力損失以及其他人類遺傳疾病的點突變的希望。

　　根據世界衛生組織 (WHO) 的數據，聽力損失是最常見的感覺缺陷之一，全球約有 5% 的人口患有致殘性聽力損失，其中 3400 萬是兒童。在兒童中，聽力損失會影響認知、語言和心理社會發展。幾乎一半的耳聾病例是由遺傳因素引起的，在不同類型的遺傳性聽力損失中，20-25% 的非綜合征性聽力損失 (NSHL) 病例為常染色體顯性遺傳。

　　迄今為止，已證實 100 多個基因與 NSHL 相關 (https://hereditaryhearingloss.org/)，并且在老齡化人群中，常染色體顯性遺傳的患病率增加，而常染色體隱性遺傳的患病率降低。例如，TMC1 是第六大最常見的遺傳性耳聾基因，TMC1 的突變導致顯性和隱性 NSHL。它的蛋白質產物 TMC1 被認為具有十個跨膜結構域，并且與 TMC2 一起形成了通道復合體的孔，這是聽覺和前庭毛細胞中聲音的機械電轉導所必需的。人類TMC1點突變（c.1253T>A；p.M418K），與Bth小鼠Tmc1突變（c.1235T>A；p.M412K）相同，顛換T>A位于第13外顯子Tmc1 序列。這種突變導致 DFNA36 聽力損失，因此 Bth 小鼠將成為 NSHL 研究的合適模型。

　　目前，臨床上很少有治療方法可以減緩或逆轉遺傳性耳聾。隨著對與聽力損失相關的遺傳的了解越來越多，人們對聽力損失基因療法的興趣也越來越大。基因替代首先被用于成功恢復小鼠的聽力。隨后的研究也證實了基因替代在治療遺傳性聽力損失方面的有效性，但基因替代不能根據細胞的需要精確調節基因表達。基因編輯技術作為一種新的基因治療方法已應用于遺傳性聽力損失的治療，并將CRISPR/Cas系統導入內耳成功改善了Bth模型小鼠的聽力損失。此外，將胞嘧啶堿基編輯器包裝到雙 AAV 中恢復了 Baringo 小鼠的基因功能，這些小鼠在 Tmc1 基因中攜帶隱性功能喪失點突變，這表明體內堿基編輯可以部分和短暫地挽救聽覺功能。

篩選用于靶向 Tmc1Bth 轉錄物的有效和特異性 sgRNA（圖源自Signal Transduction and Targeted Therapy ）

　　然而，基因組編輯可能會在與靶向序列相似的 DNA 序列中誘導脫靶突變，這限制了這種技術的實用性，特別是在治療和臨床應用中。然而，在 RNA 水平上的基因療法只改變了目標 RNA 的表達，而不影響 DNA。近年來，RNA調控已被用于治療小鼠聽力損失。例如，在小鼠模型中應用反義寡核苷酸來挽救 Ush1c (c.216G>A) 的內耳突變；RNA 干擾和人工 microRNA 降低了 RNA 表達并防止聽力損失。然而，這些傳統的 RNA 調節工具引起的廣泛的脫靶轉錄沉默一直是一個令人擔憂的問題。

　　CRISPR/Cas13作為一種新型的RNA干擾工具，是最初用于減輕細菌病毒感染的2類VI型CRISPR/Cas RNA內切酶，比傳統的RNA干擾工具具有更高的特異性。已鑒定出 Cas13 蛋白家族的四個成員，包括 Cas13a（以前稱為 C2c2）、Cas13b、Cas13c 和 Cas13d。據報道，PspCas13b 和 CasRx 比其他 Cas13 具有更高的活性和特異性。

　　作為目前最緊湊的 Cas13 酶，CasRx 可以很容易地封裝到 AAV 中，這使得 CRISPR/CasRx 系統在體內傳遞變得很方便。CasRx 已被用作肝臟和眼部疾病小鼠模型的治療工具，與其他基因編輯系統相比，RNA 編輯系統可以為基因沉默提供更安全的方法，而不會永久改變基因組。此外，protospacer flanking sequence (PFS) 對于大多數 Cas13 是必需的，限制了 sgRNA 序列的選擇，特別是對于特定的致病點突變。相比之下，CasRx 系統沒有 PFS 限制，因此可以設計和篩選更廣泛的 gRNA。

　　仍然缺乏使用 CRISPR/Cas13 RNA 編輯系統進行遺傳性耳聾治療的研究。為了探索 CRISPR/Cas13 的潛在治療效果，該研究篩選了 30 個在所有可能位置匹配單點突變的 sgRNA，以靶向 Tmc1 的致病等位基因，該研究比較了 PspCas13b 和 CasRx 系統之間的編輯特異性和效率，以選擇一個 最佳 sgRNA。

　　該研究使用新開發的 AAV 載體 AAV-PHP.eB，對內耳毛細胞具有高轉導效率，將 CasRx 和 sgRNA 遞送至出生小鼠耳蝸，并成功下調 Tmc1Bth 轉錄物的表達。Tmc1Bth/Tmc1+ mRNA 表達比率的變化，防止了進行性聽力損失，改善了毛細胞和靜纖毛束的形態，沒有可檢測到的脫靶效應。這些結果表明，CasRx RNA 編輯是一種治療遺傳性耳聾的潛在臨床方法。