2 討論
以上介紹的幾種方法基本代表了現有的啟動子克隆方法，它們分別具有不同的特點和適用范圍。
利用啟動子探針載體篩選啟動子時，不需要知道具體的基因序列，避免了引物設計，并能獲得大量的啟動子片段；其缺點是需要構建1個穿梭質粒，建庫、轉化、篩選，工作量大，費時費力，而且克隆、亞克隆的過程繁瑣。因此在基因的遺傳背景不是很清楚時，往往通過探針載體隨機篩選啟動子。
而PCR法的主要優點是簡便、快捷、操作簡單；其缺點是只能擴增兩端已知序列間的DNA區，且擴增的特異性較低。其適用條件是建立在對基因序列十分清楚的基礎上，只有知道基因的全序列，才可根據已知序列設計引物,擴增出該基因的啟動子。因此，在基因序列清楚的情況下．我們首先想到的就是PCR法。
I-PCR法操作簡單，克服了文庫篩選、克隆、亞克隆的繁瑣步驟，對實驗條件要求不高，花費少，在PCR法的基礎上，增加了DNA的環化過程，從而可以擴增只有一端序列已知的DNA，由于不需要設計和合成大量昂貴的核苷酸接頭，因此避免了引物設計和有接頭而產生的非特異性產物的麻煩；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA區域依賴于DNA的環化性，而環化連接過程中常常產生多聯體，成為副產物甚至是主要產物，導致非特異擴增，造成了閉環雙鏈的DNA的PCR擴增效率差，經常得不到滿意的結果，同時酶切片段太長也會使擴增效率下降。其適用于尋找只有一端序列已知的DNA,對未知DNA片段進行擴增。
相對于I-PCR，P-PCR經過設計形成的是鍋柄狀單鏈DNA模板，從而有效增加了引物與模板結合的特異性，p-PCR能夠完成全部嵌套式擴增，因而產物有非常高的特異性；其缺點是也存在DNA環化、連接的弊端，但與I-PCR相比，其PCR產物的特異性已大大增加。目前，P-PCR可以擴增位于已知位點側翼的大于3.0kb的人基因組DNA的啟動子，是目前為止能擴增距離已知序列最遠的DNA序列的方法．因而常用于擴增大片段的未知序列。
利用載體的PCR克隆啟動子有實驗設計簡便的優點，在基因組DNA中加入含合適酶切位點的載體，是基于PCR法的又一創新之處；然而其實驗操作較為繁瑣，特異性差，即使用套式PCR，仍然有幾條電泳條帶，因而特異性產物需雜交進一步確定。
利用接頭的PCR克隆啟動子的優點是避免了DNA環化，改進的接頭可以通過形成鍋柄結構有效抑制非特異性序列的擴增，但設計和合成大量的核苷酸接頭，價格昂貴；此外用常規的加接頭的方法來克隆啟動子時往往有接頭非特異產物產生，特異性較低，特異產物需雜交確定。由于利用接頭的PCR法不需要DNA環化，通常適用于尋找已知cDNA周圍未知啟動子或其它調控區域。
YADE法在利用接頭PCR時，巧妙地設計了“Y”型接頭，從而有效地防止接頭引物的單引物擴增，延伸時起始片段可以是基因組DNA也可以是cDNA．可用于復雜的基因組的PCR步行，能廣泛應用于真核生物；其缺點是成本較高，在應用YADE法時，為了得到合適的內切酶，需要從眾多的內切酶中篩選，另外，特殊的接頭往往也增加了實驗的成本。通常對于較復雜的真核生物基因組可以采用YADE法。
目前理想的啟動子克隆方法需要更為廣泛的，不需要PCR前的酶切、環化等操作，且特異性較高的PCR技術，TAIL-PCR基本符合這一條件。TAIL-PCR法的有以下優點：(1)方法簡單，只要設計好引物，即可用基因組DNA為模板直接進行PCR擴增；(2)特異性高，用簡并引物和特異性嵌套引物相組合，通過不對稱的溫度循環和分級反應，使最終的目的片段占絕對優勢；(3)高效靈敏，使用任何一個AD引物，在60％～80％的反應中能產生特異性產物；(4)快速，整個反應可在ld內完成，(5)避免了DNA的環化和連接，反應產物準確可靠，重復性好。TAIL～PCR的創新之處在于其熱不對稱的分級反應，有效防止了非特異產物的擴增；但是TAIL～PCR仍有很多不盡人意的地方：TAIL～PCR反應需要較多的引物組合；此外，由于隨機簡并引物存在有限的結合位點，對個別側翼序列，即使使用不同的簡并引物也難以擴增到陽性結果，整個反應需要一系列連續反應，條件設置要求精細；還要求引物和模板有較高的純度，如果有降解或純度不夠，也很難擴增出特異性條帶；此外，TAlL～PCR還很有可能擴增的是高度重復序列，因而無法步行。TAIL～PCR技術適合于分離獲得克隆載體上的DNA序列，達到克隆相關基因的啟動子的目的，也可用于基因組小的物種，如擬南芥和基因組大的物種，如小麥的已知序列兩側翼的DNA序列的分離。
3 展望
目前，啟動子克隆的方法種類繁多，進展迅速。啟動子克隆方法絕大多數是建立在PCR的基礎上的染色體步行技術，因而利用啟動子克隆的方法不僅可以克隆到基因的啟動子，同時還可以用于克隆cDNA的全長。分子生物學的一個重要問題是如何利用大量積累的基因部分序列(如EST)進一步克隆全長基因及其調控序列，而啟動子克隆方法為這一問題提供了簡便有效的手段。另外，隨著基因工程的發展，出現了越來越多的轉基因動植物，啟動子克隆的方法也可以應用在轉基因生物的研究中，如轉基因水稻的T－DNA區，通過啟動子克隆方法的PCR步行技術，能成功地克隆到T－DNA區的旁側序列，有助于分析突變體中突變區序列。
隨著PCR技術的不斷進步，一定會有更多、更好的克隆啟動子的方法產生，而它們最后也將會是克隆基因全長或突變體(特別是轉座子插入突變體)中目的基因的簡便高效的新方法。
注：
（1）參考文獻：略；需者可與本站Email聯系，或到中國水稻研究所圖書館查閱；
（2）文章來源：中國生物工程雜志，2005年25卷第7期；
（3）作者單位：黑龍江大學生命科學學院 等。