進行病毒分離為RSV感染最重要的診斷方法，RSV未發現帶毒者，分離出病毒即可確診。采取病人鼻咽棉拭子或咯痰進行病毒分離培養。該病毒不能在雞胚內增殖，只能在人和猴細胞如Hep-2，Hela等細胞株中培養增殖，約培養2～3周才出現細胞界線不清、融合成多核巨細胞等的細胞病變，病毒通過出芽釋放。用合胞病毒的免疫血清作中和試驗或補體結合試驗進行鑒定。盡管病毒分離是確診的可靠依據，但病毒生長較慢，不能及時診斷。近年來多采用臨床快速診斷法：采取患兒咽部脫落細胞，用直接或間接免疫熒光法染色進行檢查，檢測RSV感染的陽性細胞，陽性符合率可達90%以上。但其檢出率受取材部位、細胞數量和咽分泌物的影響。將咽拭子標本先接種于敏感細胞，然后用間接免疫熒光法或免疫酶法檢測，可使檢出陽性率提高。另外，由于嬰幼兒感染RSV后，抗體出現以lgM最早，故可用金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）吸收患兒血清中的lgG后，用ELISA法測定特異性lgM以作早期診斷。