響應面法優化隱甲藻產DHA的培養基（一）

響應面法優化隱甲藻產DHA的培養基

梅志剛^1[1]，王菊芳^2，*[2]

（華南理工大學  生物科學與工程學院  廣東  廣州  510006）

摘要：利用響應面法優化隱甲藻產DHA的培養基，在8種因素的單因素實驗基礎上，采用Plackett-Burman設計篩選出葡萄糖和胰蛋白粉為顯著影響因子，維持其它組分濃度在低水平不變，對以上兩因子爬坡逼近最大響應區域后利用中心組合設計和響應面分析得到最高點和主要因子的濃度。優化后的培養基組成為：葡萄糖30.54g/L, 胰蛋白粉5.03g/L，酵母粉4g/L，甘油20g/L，不添加MgCl₂和維生素溶液，其他組分同460培養基，在此培養基條件下，DHA產量達到907.54±1.02mg/L，是優化前產量的2.48倍。

關鍵字：隱甲藻，DHA，響應面

Response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium.cohnii for DHA production

MEI Zhi-gang¹, WANG Ju-fang^2,*

Abstract: On the basis of single-factor experiments, eight factors were selected for response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium cohnii. The results showed that glucose and tryptone were the significant factors by using Plackett-Burman design and other components were kept at the low concentration. Then the steepest ascent experiment was designed for the significant factors (glucose and tryptone) to reach the largest region, highest point and the concentrations of those significant factors were obtained by central composite experiments and response surface analysis. The optimized medium were as follows: glucose 30.54g/L, tryptone 5.03g/L,yeast 4g/L，glycerin 20g/L,without MgCl₂ and Vitamin solution, other components are the same with the 460 medium. After medium optimization, the DHA productivity was 907.54±1.02mg/L, as much as 2.48 times of that in primary medium.

Key words: crypthecodinium.cohnii; DHA; response surface

DHA(docosahexaenoic acid)是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，具有增強記憶，提高智力,降低血脂，調節免疫系統等功效，已經應用于臨床和流行病學和食品添加劑^[1,4]。20世紀80年代發現，隱甲藻具有較高的產DHA能力^[2]，脂肪酸積累量高于20%，DHA含量占總脂肪酸的30%~50%，是一種高效的DHA生產菌^[2,3]，來源于隱甲藻的DHA克服了傳統魚油DHA所帶有的魚腥味、富含EPA、成本高等缺點^[6]，美國哥倫比亞Mertek公司已用該菌種實現了規模化生產。

雖然目前微藻生產DHA已工業化，但生物量和DHA的產量都相對較低^[3]，人們試圖用多種方法去提高DHA產量，有優化光照條件，添加氧載體，尋找優良培養基成分，改造油脂性能等^[4]如何實現隱甲藻的高密度發酵是DHA生產的關鍵，各種培養基對隱甲藻培養產DHA影響較大，培養基優化是必要的^[4,5]。

發酵培養基是多成分，而且成分之間可能相互影響，單靠單因素和正交試驗很難很快得到較好較嚴密的結果。單因素，Plackett-Burman，最陡爬坡，中心組合設計和響應面分析的依次設計是建立在多因素，多水平基礎上，突出重要因子，步步逼近最大響應區，分析任何因子的一次項，平方項和任何兩個因子間的一級交叉作用項的數學模型，近年來在培養基優化上使用很廣。本文采取了用響應面的方法對培養基優化，以期提高隱甲藻的生物量并提高DHA產量。

1材料和方法

1.1藻種：Crypthecodinium. cohnii ATCC 30556 由中國熱帶農業科學院熱帶生物研究所提供。

1.2培養基： 460（A₂E₆） 培養基(L^-1)如下：NaCl 23.48g，MgCl₂·6H₂O 10.63g，CaCl₂1.11g，Na₂SO₄3.92g，KCl 0.66g，NaHCO₃ 0.19g，H₃BO₃ 0.03g，SrCl₂·6H₂O 0.04g，Metal Mixture 3.0ml，FeCl₃·6H₂O 0.01g，甘油磷酸鈉0.15g，Tris Buffer 3.0g，Vitamin solution 1.0ml，K₂HPO₄ 0.01g，Glucose 3.0g，甘氨酸1.5g。其中Metal Mixture如下：EDTA1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.05g，H₃BO₃ 1.0g，MnCl₂·6H₂O 0.15g，ZnCl₂ 0.01g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，H₂O 100mL。Vitamin solution如下：Biotin 0.003g，Thiamine 1g，H₂O 1L。

1.3主要測定和分析方法:

1.3.1菌種活化，培養及收集：取4℃保藏的菌種10%接入裝液量5mL試管，25℃，150r/min培養兩天后5%接種量轉接到裝液量10mL的搖瓶，25℃，150r/min培養兩天作為實驗的種子液。種子液以5%接種量接入裝液量50mL的250mL搖瓶，25℃，150r/min培養5天收集菌體。10000r/min離心10min,蒸餾水清洗3次。-40℃，0.317帕，凍干稱量至恒重。

1.3.2 脂肪酸提取：改進的Bligh--Dyer法^[9,10]。

1.3.3脂肪酸甲脂化^[13]

1.3.3色譜檢測條件：采用Agilent 7890A氣相色譜儀，FID檢測器，19091N-113 HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；載氣為N₂，進樣口溫度250℃，檢測器溫度300℃。程序升溫，130℃保溫1 min，以5℃/min升溫到250℃保溫8 min，總運行時間33.00 min。

1.3.4計算方法^[11]：每個點做三次平行取平均值，數據處理和實驗設計分別在Excel和Minitab輔助下完成

1.4單因素實驗^[7]：以460medium為基礎，外加甘油，酵母粉，胰蛋白粉，乙醇，研究其中含量較多和重要的8種成分，為PB實驗設計作參考。

1.5  Packett-Burman實驗設計^[8,12]

在單因素實驗基礎上，選取對DHA產量影響較大的8個因素，進行12次的Packett-Burman設計實驗，篩選出重要影響因子。

1.6 最陡爬坡實驗

對篩選出的因子根據方程進行最陡爬坡設計，以坡的最高點作為后續中心組合的中心點。

1.7 響應面分析

根據Box-Behnken的中心組合原理，設計合適的水平，中心點重復多次，用Minitab軟件分析，對得到的理論最高點做3次重復驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

對葡萄糖，甘油，乙醇，胰蛋白粉，酵母粉，氯化鈉，氯化鎂，維生素溶液8因子進行單因素實驗。結果表明以上組分濃度分別為30(g/L)，20(g/L)，5(g/L)，5(g/L)，5(ml/L)，24g/L，10.4g/L，1ml/L時DHA產量分別達到最高為： 521.3±1.12(mg/L)，626.24±1.02(mg/L)，709.54±1.02(mg/L)，759.07±1.12(mg/L)， 812.78±1.12(mg/L)，835.32±0.98(mg/L)，855.77±1.02(mg/L)，860.12±1.00(mg/L)。依此為Packett-Burman設計合理的濃度水平，其中原始460培養基DHA產量365.48±1.12(mg/L)。