1.4.2 肺組織標本留取 打開未經支氣管肺泡灌洗的各組各 6 只小鼠胸腔 ,觀察肺臟的大體改變 ,剪取部分肺組織 ,經10 %甲醛固定后切片 ,行 HE染色。
1.5 CD4+T細胞的分離及鑒定
1.5.1 CD4+T細胞的分離 打開小鼠腹腔 ,無菌取出脾臟放入冷 Hanks液中 ,將其捻碎并濾過 100 目無菌鋼網 ,收集脾細胞懸液加入到淋巴細胞分離液中 ,2 000 g 離心 30 min ,沿管壁輕輕吸出中間灰白色細胞層 ,重懸于含 10 % FCS的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 ×108個細胞加入尼龍毛柱中 ,37 ℃,5 %CO2孵箱中孵育 1 h;打開下端出口 ,使 T細胞懸液以 40～60 滴(Drop ,d)/ min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反復洗柱至洗脫液達 6～8 ml ,將細胞懸液按每 1 ×107個加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混勻 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分鐘輕輕旋搖 1 次 ,沿平皿壁吸取細胞懸液并用 RPMI 1640 溶液輕洗 2 次 ,2 000 g離心 10 min ,收集的細胞懸液即 CD4+T細胞。經臺盼藍計數 ,細胞存活率 > 89 %。
1.5.2 CD4+T細胞純度鑒定 采用流式細胞術(Flow cytom2etry ,FCM)鑒定 CD4+T細胞純度[1]。
1.6 統計學分析 各組結果以 ?x ±s 表示 ,各組間比較采用非配對 t 檢驗。
2 結果
2.1 小鼠致敏模型的肺組織病理改變 致敏組小鼠的肺臟與正常對照組小鼠的肺臟相比體積明顯增大 ,表面腫脹 ,有多處形狀不規則的暗紅色充血區。切面有白色泡沫狀滲出物 ,并可見明顯的血管斷面。肺組織切片HE 染色可見支氣管及血管周圍有大量的炎性細胞浸潤 ,以EOS為主 ,肺間質及肺泡腔內也可見 EOS浸潤。細小的支氣管內可見粘液栓。氣道上皮多處斷裂 ,基底膜明顯增厚且形態不規則。細支氣管平滑肌發生肥厚性增生。
2.2 外周血及 BALF中 EOS %
2.2.1 外周血 EOS% 致敏組小鼠外周血 EOS%(11. 0 ±2.7)與正常對照組(0.7 ±0.5)比較顯著增高( P < 0.01) 。
2.2.2 BALF中 EOS% 正常對照組小鼠 BALF 中幾乎沒有EOS(0.0 ±0.01) ,致敏組小鼠 BALF 中 EOS%(21. 9 ±4. 4) 與正常對照組比較顯著升高( P < 0.01) 。
2.3 CD4+T細胞純度鑒定結果
經 FCM檢測 ,CD4+T細胞的純度為 97.3 % ,見圖 1。
圖 1 FCM檢測 CD4+T細胞純度
3 討論
本實驗建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表現為:肺臟明顯水腫 ,細、小支氣管內有多量的粘液栓 ,氣道上皮斷裂、脫落 ,基底膜增厚 ,支氣管及肺血管周圍有以 EOS為主的大量炎性細胞浸潤 ,與哮喘的病理學特點相似 ;同時 ,此模型小鼠外周血及 BALF中 EOS %顯著增加 ,與哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改變一致 ,說明此模型可用于哮喘的實驗研究。
Panning 法又稱洗淘法。它是運用抗原與抗體相結合的原理進行細胞分離的一種方法 ,具有簡便 ,經濟、細胞完整性好等特點。國外在 90 年代早、中期即將這種方法廣泛用于實驗中。隨著科學技術的不斷進步 ,目前國外用于分離細胞的方法主要是磁珠分離法[2]和流式細胞儀法[3],但其造價昂貴 ,在國內并不能
普遍開展 ,故運用 Panning 法分離細胞仍不失為一種高效、經濟的方法。本實驗用 Panning 法分離的 CD4+T細胞經 FCM檢測 ,純度高 ,完全可用于進一步的實驗研究。
關鍵詞 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T細胞
中圖法分類號 : R - 332;R562.25 文獻標識碼 : B
參考文獻 :
[1] 沈關心 ,周汝麟. 現代免疫學實驗技術[M]. 武漢:湖北科學技術出版社 , 1998.180 - 183.
[2] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al. Antigen2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin24 production by CD4+Tcells[J ]. EurJ Immunol ,1997 ,27(10) :2 657 - 2 665.
[3] Denkers E Y, Scharton2Kersten T, Barbieri S, et al. A role for CD4+NK1.1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectorsfunction against in2tercellular infection[J ]. J Exp Med ,1996 , 184(1) : 131 - 139.
(編輯 陳聰連)