哺乳動物細胞制備核和細胞質提取物—核提取物制備優化

轉瓶或單層培養的哺乳動物細胞（如HeLa細胞）

高鹽緩沖液分別含 0.8、1.0、1.2、1.4 及 1.6 mol L KCl

貝克曼 JS4. 2 轉子或相當的轉子50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管）Dounce 氏玻璃勻漿器（B 型研杵）Beckman JA-20 離心轉子或相當的轉子磁性攪拌器或傾斜臺管型透析膜（14000 MWCO）電導計

1) 按基本方案中步驟1?8操作。

2) 在低鹽緩沖液中重懸細胞核后（1/2體積pnv，見基本方案步驟8)，將細胞核懸液分成5等份。

3) 在冷室內不斷攪拌，按如下方法在每份懸液中加入1/3體積高鹽緩沖液：在第1份 中加KCl濃度最低（0.8 mol/L)的高鹽緩沖液，其余各份中依次加入KCl濃度逐 漸增高（直到1. 6 mol/L)的高鹽緩沖液。

4) 確定在離心管斜面上有提取出的細胞核，輕輕混合30 min。

5) 25000 g離心30 min,除掉核。

6) 將上清輕輕倒出，進行透析（見基本方案步驟12)，直到加KCl濃度最高的那份核懸液的電導率達到與透析液一致（100 mmol/L KCl)。提取物25000 g離心20 min。

7) 檢測各份提取物的電導率并測定蛋白質濃度（見基本方案步驟13和14)。

8) 直接分析提取物或分裝到試管中，在液氮中速冷后放入-80℃保存。